乙醇法制備葛花醇提物的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性*

陳惠卿，陳惠婷，張穎，謝三都,3，張怡

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002； 2.閩南科技學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，福建 泉州362332；3.閩南科技學(xué)院 食品科學(xué)研究所，福建 泉州 362332）

葛花（Puerariae Flos）屬豆科植物野葛的花蕾，富含多種生物活性成分，包括黃酮類化合物、皂苷類、花青素、氨基酸、生物堿類及揮發(fā)油等，且黃酮類化合物含量最高，是葛花的主要功能性成分[1,2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化，降血脂，降血糖，消除炎癥等生理藥理功效，是開發(fā)功能性食品和制備高效低毒藥物的重要原料[3-5]。因此，葛花作為傳統(tǒng)的藥食兼用原料備受科研界關(guān)注。

黃酮類化合物屬于自然界中分布較廣的酚類物質(zhì)，為植物生長過程中產(chǎn)生的一類次生長代謝產(chǎn)物，主要包括黃烷-3-醇、花色苷和黃酮，是一種天然抗氧化劑[6-9]。黃酮類化合物難溶于水，不具揮發(fā)性，易溶于有機(jī)溶劑和稀堿液，常見的提取方法有醇提法、堿法、有機(jī)溶劑萃取法、微波輔助提取、超聲波輔助提取等[10-12]。其中，醇提法具有產(chǎn)物雜質(zhì)少、提取率高、對設(shè)備要求簡單等優(yōu)點(diǎn)[13,14]。本文以葛花為原料，以葛花總黃酮為指標(biāo)，采用乙醇浸提法制備葛花醇提物，在考察了乙醇濃度、料液比、浸提溫度和時(shí)間對葛花醇提物中總黃酮提取效果影響的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其提取工藝條件；同時(shí)，以茶多酚為陽性對照，通過探討葛花醇提物對羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除效果來研究其體外抗氧化性能。研究為進(jìn)一步利用葛花資源提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料與試劑

原料：葛花，東南醫(yī)藥連鎖有限公司。

試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，生化試劑，上海源葉生物科技有限公司；硫酸亞鐵、1,10-菲咯啉、雙氧水、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、濃硝酸，西隴科學(xué)股份有限公司；無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、焦性沒食子酸、硫酸鐵、三氯乙酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基，上海麥克林生化科技有限公司；以上藥品均為分析純。2-硫代巴比妥酸試劑，生物試劑，西隴科學(xué)股份有限公司。茶多酚，食品級，江西富之源生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

BO-150T多功能粉碎機(jī)，永康鉑歐五金廠；RV10數(shù)顯旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；LGJ-12型真空冷凍干燥機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；TDL-60C低速臺式離心機(jī)，泉州天美化工儀器有限公司；78-1磁力攪拌機(jī)，金壇市富華儀器有限公司；HWS-28恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；FA2004電子天平，上海衡平儀器儀表廠；721型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；N4S紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；FC-6烘干箱，廣東多麗食品機(jī)械有限公司；G-100s 超聲波清洗機(jī)，深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葛花醇提物的制備工藝流程

葛花粉碎、過80目篩，40 ℃下烘干至恒重→乙醇溶液恒溫浸提→提取液過濾除渣→濾液真空濃縮→濃縮液冷凍干燥→凍干品冷藏貯存。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照錢慧琴[15]等文獻(xiàn)中所述三氯化鋁顯色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=1.2394x+0.0025，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995，說明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在質(zhì)量濃度為0~0.5 mg/mL范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系。

1.3.3 葛花醇提物中總黃酮提取率的測定

參照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，準(zhǔn)確稱取一定量的葛花醇提物凍干粉，溶于相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，用25 mL的容量瓶定容，充分搖勻后常溫靜置30 min，同時(shí)以相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液代替樣品做空白試驗(yàn)。按以下公式計(jì)算葛花總黃酮提取率（%）：

式中：

1.3.4 葛花總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 料液比對葛花總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.5 g葛花粉末，分別按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 g/mL的比例加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液，在60 ℃下恒溫水浴提取10 min，抽濾除渣，濾液冷凍干燥；取一定量的葛花總黃酮凍干粉溶于體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定葛花總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.3.4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對葛花總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.5 g葛花粉末，按料液比為1∶80(g/mL)的比例分別加入體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%的乙醇溶液，在60 ℃下恒溫水浴提取10 min，抽濾除渣，濾液冷凍干燥；取一定量葛花總黃酮凍干粉溶于相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定葛花總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.3.4.3 浸提溫度對葛花總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.5 g葛花粉末，按料液比為1∶80(g/mL)的比例加入體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液，分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃下恒溫水浴提取10 min，抽濾除渣，濾液冷凍干燥；取一定量的葛花總黃酮凍干粉溶于體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定葛花總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.3.4.4 浸提時(shí)間對葛花總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取0.5 g葛花粉末，按料液比為1∶80(g/mL)的比例加入體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液，在50 ℃下分別恒溫水浴提取5、10、15、20、25、30、35 min，抽濾除渣，濾液冷凍干燥；取一定量的葛花總黃酮凍干粉溶于體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定葛花總黃酮提取率，重復(fù)3次。

1.3.4.5 乙醇浸提法提取葛花總黃酮的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，探討料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、浸提溫度（C）和時(shí)間（E）對葛花總黃酮提取效果的影響，采用5因素4水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)優(yōu)化葛花總黃酮的提取工藝條件，其因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 葛花醇提物抗氧化性能的測定

1.3.5.1 茶多酚溶液的制備

參照文獻(xiàn)[16]中茶多酚溶液的制備方法，具體如下：準(zhǔn)確稱取1.00 g的茶多酚，用蒸餾水溶解后定容至500 mL，制備成2.0 mg/mL的茶多酚溶液，并稀釋成濃度所需要各濃度的茶多酚溶液，備用。

1.3.5.2 葛花醇提物對羥自由基清除能力的測定

以茶多酚作為陽性對照，配制不同濃度葛花醇提物，參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定葛花醇提物中葛花總黃酮濃度，參考陳紅梅[17]等文獻(xiàn)中所述羥自由基清除率的測定方法研究葛花醇提物清除羥自由基的性能，重復(fù)3次。

1.3.5.3 葛花醇提物對超氧自由基清除能力的測定

以茶多酚作為陽性對照，配制不同濃度葛花醇提物，參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定葛花醇提物中葛花總黃酮濃度，參考楊喆[18]等文獻(xiàn)中所述超氧自由基清除率的測定方法研究葛花醇提物清除超氧自由基的性能，重復(fù)3次。

1.3.5.4 葛花醇提物對DPPH自由基清除能力的測定

以茶多酚作為陽性對照，配制不同濃度葛花醇提物，參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定葛花醇提物中葛花總黃酮濃度，參考韋獻(xiàn)雅[19]等文獻(xiàn)中所述DPPH自由基清除率的測定方法研究葛花醇提物清除DPPH自由基的性能，重復(fù)3次。

1.3.5.5 葛花醇提物對ABTS自由基清除能力的測定

以茶多酚作為陽性對照，配制不同濃度葛花醇提物，參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定葛花醇提物中葛花總黃酮濃度，參考CAMPOS[20]等文獻(xiàn)中所述ABTS自由基清除率的測定方法研究葛花醇提物清除ABTS自由基的性能，重復(fù)3次。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0數(shù)據(jù)分析軟件對變化顯著性分析；使用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛花總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 料液比對葛花總黃酮提取率的影響

如圖2所示，葛花總黃酮提取率隨料液比的增大整體呈現(xiàn)先緩慢上升后趨于平穩(wěn)的現(xiàn)象。當(dāng)料液比為1∶80(g/mL)時(shí)，葛花總黃酮提取率達(dá)到最高值為(1.93±0.042)%，P＜0.01。溶質(zhì)和溶劑接觸的表面積會隨溶劑量的增大而增加，從而加速溶質(zhì)的溶出，葛花總黃酮提取率上升；而隨著溶劑量的繼續(xù)增加，總黃酮基本都已溶出，提取率不再有顯著變化[21]。因此，料液比宜選擇1∶80(g/mL)。

圖2 不同料液比對葛花總黃酮提取率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對葛花總黃酮提取率的影響

如圖3所示，隨著乙醇濃度的增大，葛花總黃酮提取率呈現(xiàn)先顯著升高再陡降，而后趨于平穩(wěn)，進(jìn)而急劇下降的現(xiàn)象。當(dāng)乙醇濃度為10%時(shí)，葛花總黃酮提取率最高為(1.98±0.028)%，P＜0.01。一方面，乙醇體積分?jǐn)?shù)不同其極性亦不同，葛花總黃酮的極性可能與體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液最為接近，根據(jù)相似相溶原理，黃酮類化合物在此時(shí)能最大限度從固體載體中轉(zhuǎn)移到溶液中，故溶解度最高[22]；另一方面，植物組織中含有多種醇溶性物質(zhì)，如色素、精油等，而高濃度的乙醇溶液會增加這些成分的溶出量，使之同黃酮類化合物競爭乙醇-水分子體系，從而表現(xiàn)為總黃酮提取率在保持平衡一段時(shí)間后出現(xiàn)下降的現(xiàn)象[23]。因此，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)宜選擇10%。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對葛花總黃酮提取率的影響

2.1.3 浸提溫度對葛花總黃酮提取率的影響

如圖4所示，隨著浸提溫度的上升，葛花總黃酮提取率呈現(xiàn)先緩慢上升后急劇下降的趨勢。當(dāng)浸提溫度為50 ℃時(shí)，葛花總黃酮提取率達(dá)到最高值為(2.21±0.057)%，P＜0.05，但30、40、50 ℃三個(gè)水平在α=0.01水平上差異不顯著。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)在高溫作用下會被破壞，且高溫也會使乙醇揮發(fā)，濃度下降，表現(xiàn)為總黃酮提取率下降[24]。因此，浸提溫度選擇50 ℃左右為宜。

圖4 不同浸提溫度對葛花總黃酮提取率的影響

2.1.4 浸提時(shí)間對葛花總黃酮提取率的影響

如圖5所示，隨著浸提時(shí)間的延長，葛花總黃酮提取率先顯著升高后大幅度下降。當(dāng)浸提時(shí)間為10 min時(shí)，葛花總黃酮提取率達(dá)到最大值為(2.40±0.028)%，P＜0.01。延長浸提時(shí)間，溶劑對溶質(zhì)的溶脹和滲透作用有助于黃酮類物質(zhì)向溶劑擴(kuò)散，提取率上升；但過度延長浸提時(shí)間，葛花中其他醇溶性物質(zhì)大量溶出，與黃酮類物質(zhì)共同競爭溶出，從而導(dǎo)致總黃酮提取率驟降[25]。因此，浸提時(shí)間以10 min為宜。

圖5 不同浸提時(shí)間對葛花總黃酮提取率的影響

2.1.5 乙醇浸提法提取葛花總黃酮的正交試驗(yàn)

如表2所示，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，比較各列的極差結(jié)果R值可知，RE＞RB＞RA＞RC，即各因素對葛花總黃酮提取率的影響程度大小為浸提時(shí)間（E）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）＞料液比（A）＞浸提溫度（C）；即在試驗(yàn)所設(shè)定的因素水平中，浸提時(shí)間對葛花總黃酮提取率的影響最為顯著，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比，浸提溫度的影響程度最小。通過對K值的比較可知，A3B4C1E3為最優(yōu)組合，即乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，料液比1∶80 (g/mL)，浸提溫度30 ℃，浸提時(shí)間15 min。為驗(yàn)證最優(yōu)工藝的有效性，以最優(yōu)組合提取葛花總黃酮，重復(fù)3次，所得葛花總黃酮提取率為(2.71±0.018)%，RSD=0.9327%，表明該提取工藝條件穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2 葛花醇提物抗氧化性能的研究

2.2.1 葛花醇提物清除羥自由基性能的研究

如圖6所示，葛花醇提物對羥自由基的清除能力隨其含有的葛花總黃酮質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)，且具有極顯著影響，P＜0.01，這與陳紅梅[17]、李玲[26]等對黃酮類物質(zhì)抗氧化性能的研究結(jié)果相一致，表明葛花醇提物對羥自由基的清除效果與其含有的葛花總黃酮呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。當(dāng)葛花醇提物中葛花總黃酮質(zhì)量濃度為0.047 mg/mL時(shí)，其對羥自由基的清除率顯著高于0.2 mg/mL的茶多酚，P＜0.01，表明葛花醇提物對羥自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖6 葛花醇提物對羥自由基清除能力的影響

2.2.2 葛花醇提物清除超氧自由基性能的研究

如圖7所示，葛花醇提物對超氧自由基的清除能力隨其含有的葛花總黃酮質(zhì)量濃度的增大而顯著加強(qiáng)，且具有極顯著影響，P＜0.01，這與羅秋水[27]、張兆英[28]、張曉文[29]等關(guān)于植物黃酮類物質(zhì)對超氧自由基的清除能力研究相一致，表明葛花醇提物對超氧自由基的清除效果與其含有的葛花總黃酮呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。當(dāng)葛花醇提物中葛花總黃酮質(zhì)量濃度為0.019 mg/mL時(shí)，其對超氧自由基的清除率顯著高于0.5 mg/mL的茶多酚，P＜0.01，表明葛花醇提物對超氧自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖7 葛花醇提物對超氧自由基清除能力的影響

2.2.3 葛花醇提物清除DPPH自由基性能的研究

如圖8所示，葛花醇提物對DPPH自由基的清除能力隨其含有的葛花總黃酮質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)，且具有極顯著影響，P＜0.01，表明葛花醇提物對DPPH自由基的清除效果與其含有的葛花總黃酮呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。因?yàn)辄S酮類化合物分子和茶多酚中均含有具備供氫能力的酚性羥基，當(dāng)孤對電子與還原態(tài)氫進(jìn)行配對時(shí)，DPPH·即被還原形成DPPH-H，表現(xiàn)出顯著的抗氧化能力[30]，當(dāng)葛花醇提物中葛花總黃酮質(zhì)量濃度為0.026 mg/mL時(shí)，其對DPPH自由基的清除率與0.05 mg/mL的茶多酚無差異，P＞0.05，表明了葛花醇提物對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖8 葛花醇提物對DPPH自由基清除能力的影響

2.2.4 葛花醇提物清除ABTS自由基性能的研究

如圖9所示，葛花醇提物對ABTS自由基的清除能力隨其含有的葛花總黃酮質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)，且具有極顯著影響，P＜0.01，表明葛花醇提物對ABTS自由基的清除效果與其含有的葛花總黃酮呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。不同于供氫清除DPPH自由基，ABTS自由基被抗氧化劑清除的過程是電子轉(zhuǎn)移過程，而黃酮類化合物和茶多酚均具備較強(qiáng)電子供應(yīng)能力[31]，當(dāng)葛花醇提物中葛花總黃酮質(zhì)量濃度為0.038 mg/mL時(shí)，其對ABTS自由基的清除率與0.15 mg/mL的茶多酚無差異，P＞0.05，表明了葛花醇提物對ABTS自由基有較強(qiáng)的清除能力。

圖9 葛花醇提物對ABTS自由基清除能力的影響

3 結(jié)論

在采用乙醇法提取葛花總黃酮過程中，在所選因素與水平范圍內(nèi)，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間對葛花總黃酮提取率的影響極顯著，P＜0.01，其最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1∶80 g/mL、浸提溫度30 ℃、浸提時(shí)間15 min，在此工藝條件下葛花總黃酮提取率為(2.71±0.018)%。綜合葛花醇提物對羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力可知，葛花醇提物中葛花總黃酮濃度不同對其抗氧化能力的影響差異極顯著，P＜0.01，且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。以茶多酚作陽性對照，葛花醇提物具有較強(qiáng)的抗氧化能力。