DOT1L，治療骨關節炎的新靶點

逯愛梅，孫水，于辰曦

(1.山東省公共衛生臨床中心臨床藥學部，山東 濟南 250000；2.山東第一醫科大學附屬省立醫院骨關節科，山東 濟南 250021)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)，也稱為退行性關節疾病，近年來隨著老年人口的增多以及肥胖的流行其發病率不斷提高，這給家庭、社會帶來沉重的負擔。然而，目前的治療措施僅僅是減輕疼痛、緩解關節僵硬和維持關節功能，尚未有一種有效的對因治療方法，其中一個重要原因是OA的確切發病機制尚不十分明確[1]。目前普遍認為 OA是一種多因素疾病，其中遺傳學、表觀遺傳學因素發揮著重要作用，已成為近來OA發病機制的研究熱點[2-4]。

類端粒沉默干擾體1(disruptor of telomeric silencing 1-like，DOT1L)是目前唯一的已知組蛋白H3賴氨酸79(histone H3 lysine 79，H3K79)甲基轉移酶，可以S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)為甲基供體特異性地催化H3K79進行單甲基化、二甲基化和三甲基化[5]。大量研究顯示DOT1L介導的H3K79甲基化參與了調節端粒沉默(telomeric silencing)、胚胎發育、DNA修復、細胞周期、基因轉錄等生理生化過程[5]。近來研究發現DOT1L在維持關節軟骨穩態(homeostasis)、抑制OA發生發展方面發揮著重要作用[6-14]，并有可能成為OA治療的新靶點。本文將在簡介DOT1L結構特點與活性、Wnt信號通路調控關節軟骨發育作用的基礎上，重點闡述DOT1L在OA發生發展中的作用。

1 DOT1L的結構特點與活性

DOT1L從酵母到人類都是高度保守的，是迄今為止唯一一個被證實不含SET{Su(var)3-9,Enhancer of Zeste[E(z)],and Trithorax(trx)}催化結構域(domain)的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(histone lysine methyltransferases)。全長度人DOT1L蛋白由1 537個氨基酸構成，分子質量為165 kDa，但僅N末端～360氨基酸序列與酵母Dot1具有明顯的序列相似性[15]。其中，1～416氨基酸含組蛋白甲基轉移酶催化結構域[15]。該結構域由以下3部分構成：①N末端結構域：由5個α螺旋(αA～αE)和2對短β發夾(β1、β2和β3、β4)構成；②C末端結構域：由7股β折疊(β5～β11)和5個α螺旋(αF～αJ)構成的開放α/β結構，中間為 L-EF環(loop L-EF)將兩末端連接在一起。αF～αH螺旋位于β折疊前側，而αI、αJ位于對側。β折疊中，β5～β9和β10是同向的，但位于β9和β10之間的β11則呈反方向。緊隨β11的αK螺旋，并遠離結構中心。N末端與αF～αH螺旋位于β折疊同一側。C末端(319～416氨基酸殘基)是一個柔性的正電荷區域,可通過靜電相互作用的方式識別并結合帶負電的核小體,以實現對H3K79的催化作用；③SAM結合結構域：SAM分子作為甲基供體，位于由 L-EF環形成的SAM結合口袋(binding pocket)內。該結合口袋的入口處較寬，但在靠近蛋白質中心處變得較窄，由D1、Ⅰ、Ⅰ′、D2和Ⅱ等5個區構成，其中D1區位于L-EF環內的133～139氨基酸殘基，形成結合口袋的右前部；Ⅰ區位于β5-環-αG內的161～169氨基酸殘基；Ⅰ′區位于β6-環-αH內的186～189以及191氨基酸殘基，Ⅰ區和Ⅰ′區共同形成結合口袋的背面；D2區位于環 L-7I內的221～224氨基酸殘基，形成結合口袋入口的背面；Ⅱ區位于環 L-18內的239～245氨基酸殘基，形成結合口袋的左側。Ⅰ、Ⅰ′和Ⅱ區存在與其他SAM依賴性甲基轉移酶相同的共有序列模序(consensus sequence motifs)[16]，但D1、D2區是DOT1L所特有的而其他甲基轉移酶沒有的序列。

Lys結合通道(lysine binding channel)位于D1區，由其內部分子間的相互作用而形成。Glu138可與N末端αD螺旋的Tyr115形成一個氫鍵，也可與相鄰的Tyr136形成一個氫鍵，后者又可通過一個埋藏的水分子與Gln168發生相互作用。這些相互作用既可穩定L-EF環，又可形成通向SAM結合口袋內部的通道。該通道最狹窄處約4 ?，可容納1個單-、雙-或三-甲基化的Lys通過，其開放與關閉為Phe243-Trp305 相互作用所調節。SAM上的甲基排列在通道內，H3K79沿此通道到達其活性部位。

2 Wnt信號通路對關節軟骨發育的精準調控作用

Wnt信號通路是高度保守的信號轉導通路，分為Wnt/β-catenin信號通路、Wnt/Planar Cell Polarity(PCP)和Calcium(Ca2+)信號通路。其中，Wnt/β-catenin信號通路被稱之為經典Wnt信號通路，具β-catenin依賴性；后兩者被稱之為非經典Wnt信號通路，具非β-catenin依賴性。Wnt/β-catenin信號通路的啟動始于Wnt配體與受體Fz結合釋放游離β-catenin，進入細胞核與LEF/TCF家族的轉錄因子結合，從而激活下游靶基因轉錄。目前Wnt配體家族共19個成員，其中Wnt2b、Wnt3、Wnt5a、Wnt5b、Wnt10a和Wnt10b在關節軟骨中穩定表達，但只有Wnt16可在受損關節軟骨中被快速上調(upregulation)且與β-catenin的表達相一致[17]。Chen等[18]在研究顳下頜髁突軟骨發育時發現Wnt4、Wnt5a和Wnt 9a可在髁突芽基部以及后來不同的軟骨層高度表達但在成人下頜髁突軟骨中沒有表達，提示生理情況下Wnt信號通路在軟骨中的表達時空上受到精準調控。這一精準調控模式表現在關節軟骨的不同發育時期Wnt信號通路發揮的作用不同，如在關節軟骨發育早期決定著間充質細胞(mesenchymal cells,MCs)是分化成成骨細胞還是軟骨細胞、在關節軟骨發育后期促進肥大軟骨細胞分化、在軟骨內和膜內骨化過程中促進成骨細胞的分化和成熟等[19-22]；另一方面，Wnt信號通路的不同信號分子在關節發育的同一時期發揮的作用也不盡相同，如Wn1、Wnt4和Wnt8A抑制軟骨生成(chondrogenesis)和MCs分化成軟骨細胞，而Wnt5a、Wnt5b和Frzb/Frp3/Sfrp3則呈現促進作用[22]。一旦這一精準調控模式失調，關節軟骨Wnt信號通路過度活化則會引發OA的發生發展[19-24]，這從另一個側面也反映出Wnt信號通路在調控關節軟骨發育與穩態的重要作用。采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默Wnt5a激活成年小鼠關節軟骨內的Wnt信號通路可導致關節軟骨進行性丟失、骨贅形成等OA樣表型的發生[23]。相反，一些Wnt信號通路拮抗劑如lorecivivint(SM04690)的體內、體外試驗均證實可抑制OA的發生發展[24]。

3 DOT1L在OA發生發展中的作用

3.1 DOT1L基因單核苷酸多態性增加髖、膝OA易感性 近來有多家研究團隊開展了DOT1L基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)與髖、膝OA易感性(susceptibility)之間相關性的研究。Castano-Betancourt 等[9]針對6 523名鹿特丹人進行全基因組關聯研究(genome-wide association studies，GWAS)，以關節間隙寬度(joint space width,JSW)為參數，發現染色體19p13.3 rs12982744位點G等位基因與JSW增寬5%有關，并在4 442名英國人中也得到驗證，研究還顯示該SNP位于DOT1L基因的第一個內含子，提示DOT1L基因SNP與髖關節OA有關[9]。Evangelou等[10]針對9 789例髖OA患者(男4 155例，女5 634例)、31 873例正常健康人(男15 213例，女16 660例)進行meta分析，發現男性患者DOT1L基因 rs12982744 C等位基因與髖OA風險增加17%有關，并具有全基因組學意義。Castano-Betancourt等[13]在2016年的研究發現位于DOT1L基因內含子區rs1180992位點與rs12982744位點非常接近并處于連鎖不平衡狀態，與髖OA的發生發展有關。García-Alvarado 等[11]針對墨西哥東北部麥士蒂索(Mestizo)人的研究發現DOT1L rs12982744位點與膝OA之間無顯著相關性。Zhou等[12]針對605例中國漢族膝OA患者、615例年齡性別相匹配的正常健康人進行的研究，發現DOT1L基因rs12982744 GC、CC基因型和變異體C可增加中國漢族人患膝OA的風險，并且老年人(>65歲)和女性患者GC雜合子比GG純合子患膝OA風險更大；而rs12459350 GA、AA基因型與膝OA的風險無顯著相關性，且進一步按年齡或性別進行分層分析也未顯示出顯著相關性。盡管Castano-Betancourt 等[13]發現DOT1L基因在系統優先順序研究(systematic prioritization study)中沒有獲得高分，上述DOT1L基因SNPs與髖、膝OA易感性之間相關性研究結果提示DOT1L基因SNP與髖、膝OA易感性有關，并且體內、體外實驗研究結果[6-8]進一步證實DOT1L基因是OA的致病基因(causal gene)。

3.2 DOT1L參與維持關節軟骨穩態 DOT1L分布于生長板(growth plate)和關節軟骨，尤其是富集于肥大前軟骨細胞(prehypertrophic chondrocytes)和肥大軟骨細胞(hypertrophic chondrocytes)[9,14]；也分布于正常關節軟骨及OA樣組織中[8]。Castano-Betancourt等[9]以可模擬軟骨細胞分化過程的ATDC5細胞為研究對象，敲低(knock down)DOT1L基因后采用阿爾新蘭染色和蕃紅O染色法顯示細胞合成的硫酸蛋白聚糖(proteoglycan)較對照組細胞分別減少1.35倍和2.5倍，茜素紅染色法顯示礦化作用減少1.4倍，天狼星紅染色法顯示膠原含量減少1.8倍，提示敲除DOT1L基因(DOT1L-)可明顯干擾關節軟骨形成。Monteagudo 等[8]采用免疫組化法發現甲基化H3K79的信號強度在OA患者關節軟骨損傷區相比非損傷區以及非OA患者的關節軟骨降低，而DOT1L基因在OA患者關節軟骨損傷區和非損傷區的表達卻沒有明顯差異。體外實驗發現，給予DOT1L抑制劑EPZ-5676不僅可抑制體外原代培養人關節軟骨細胞H3K79甲基化，而且可誘導Ⅱ型糖原(COL2A1)分泌減少、Ⅰ型糖原分泌增加等OA樣分子譜的發生[8]。體內實驗也發現小鼠關節腔內注射EPZ-5676可有效抑制關節軟骨細胞H3K79甲基化，并增加軟骨損傷[8]。條件敲除DOT1L基因小鼠(DOT1L-cKOPrrx1)表型特征顯示肢體縮短、骨形態異常和前肢脫位[6]。也有研究發現小鼠軟骨細胞中DOT1L產前缺失可導致圍產期死亡、骨化加速和Col10a1表達失調，出生后小鼠軟骨細胞DOT1L缺失導致小梁骨丟失、細胞外基質生成減少并且生長板破裂[25]。采用內測半月板失穩誘發OA小鼠及軟骨特異性DOT1L敲除(knock out)鼠(DOT1LCART-KO)為研究對象，發現DOT1L失活可導致OA的發生發展[7]。此外，DOT1L基因還可抑制破骨細胞生成[26]，可能也與其抑制OA發生發展有關。基于上述研究，可以得出結論DOT1L在維持關節軟骨穩態中發揮著重要作用。

3.3 DOT1L維持關節軟骨穩態的機制 人們在研究DOT1L與白血病的關系時發現DOT1L可調節Wnt信號通路活性[27]，由此推測DOT1L維持關節軟骨穩態的作用也可能與Wnt信號通路有關。Castano-Betancourt等[9]以DOT1L-ATDC5細胞為研究對象，發現Wnt信號通路正向調節靶基因如Tcf1、Axin2和c-Myc表達無變化，但負向調節靶基因如骨鈣蛋白(osteocalcin)表達則上調(upregulation)，這為DOT1L可調節軟骨細胞Wnt信號通路提供了實驗依據。進一步的實驗顯示，采用特異性DOT1L小分子抑制劑EPZ-5676后人或小鼠關節軟骨細胞內的活性β-catenin濃度沒有發生變化，表明DOT1L調節Wnt信號通路的靶點在通路下游[8]。抑制DOT1L或用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)可上調LiCl處理軟骨細胞內Wnt靶基因(LEF1、TCF1和c-MYC)RNA水平，而Wnt抑制劑XAV-939可拮抗小鼠關節注射EPZ-5676所誘發的OA[8]。由此可以的結論，DOT1L維持關節軟骨細胞穩態是通過負性調節Wnt 信號通路實現的。

在研究DOT1L是如何抑制Wnt信號通路時，意外發現采用沉默信息調節蛋白1(Sirtuin1，Sirt1)特異性抑制劑EX527可拮抗DOT1L抑制劑所誘導的LiCl處理細胞LEF1、TCF1上調，而Sirt1特異性激動劑SRT1720呈現相反的作用，表明Sirt1介導了DOT1L對Wnt信號通路的抑制作用[8]。抑制或者敲除DOT1L可上調軟骨細胞內Sirt1活性，而當給C57/B16野生型小鼠膝關節腔內同時注射EX527與EPE-5676時發現EX527可有效降低EPZ-5676誘導OA的嚴重程度并可逆轉Wntt信號通路的過度活化，表明DOT1L可抑制軟骨細胞內Sirt1活性[8]。染色質免疫共沉淀定量PCR(chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR，ChIp-qPCR)顯示細胞經EPZ-5676處理后，轉錄激活因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1-α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1-alpha，PPARGC1A)和組蛋白乙酰轉移酶KAT2A富集在LEF1和TCF1啟動子上，而SIRT1抑制劑EX527可對抗EPE-5676對Wnt/β-catenin信號通路靶點的抑制作用并可降低PPARGC1A和KAT2A對LEF1和TCF1啟動子的占據[8]。由此可以得出結論，DOT1L抑制Sirt1作用可能是其控制關節軟骨細胞內Wnt信號通路活性以維持關節軟骨健康、抑制OA發生發展的主要機制。

4 展望

目前研究顯示出DOT1L是通過調控Sirt1-Wnt信號通路實現的，且突變與表型相關性分析結果在歐洲人和中國漢族人中均得到證實，顯示出DOT1L作為OA治療的靶點具有較好前景。實事求是地講，目前研究仍在初期階段，以下問題還要進一步明確：①OA是多因素疾病，現已開展的研究僅限于DOT1L突變對關節軟骨細胞外基質的影響，今后還應擴大研究范圍以明確突變對炎癥、自噬、凋亡、老化等因素的影響；②DOT1L基因在人類是高度保守且分布廣泛，Sutter等[6]發現條件敲除DOT1L基因可導致小鼠(DOT1L-cKOPrrx1)出現復雜的表型改變，提示仍需要大量的研究來驗證其作為OA治療靶點的特異性；③Wnt信號通路對關節軟骨功能的調控非常精細，過度活化或降低均可導致OA的發生[19-22]。DOT1L維持關節軟骨穩態是通過抑制Wnt信號通路活性實現的，作為靶點如何實現對Wnt信號通路的精準調控是未來要重點研究的內容之一。只有這樣才能防止DOT1L作為靶點時Wnt信號通路被過度抑制誘發OA再發生或惡化，又保留DOT1L對關節軟骨的有益作用。