梅花鹿角和馬鹿角的蛋白質(zhì)組成與分析

張海蓮，陳曉，王玉團(tuán)

(1.菏澤市立醫(yī)院，山東 菏澤 274031；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101)

鹿角始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為鹿科動(dòng)物馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)或梅花鹿(CervusNipponTemminck)已骨化的角，分別習(xí)稱馬鹿角和梅花鹿角，功能為溫腎陽，強(qiáng)筋骨，行血消腫[1-2]，臨床上主要用于治療人體腎陽虛衰之癥，因療效非常確切，故應(yīng)用廣泛。

目前對鹿角的研究主要集中在蛋白酶解工藝及蛋白和多肽藥理作用方面[3-4]，也有微量元素分析[5-7]、多糖測定[8]和氨基酸分析[9]等方面的研究報(bào)道，但對鹿角的生物活性成分蛋白質(zhì)組成方面的研究較少。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對鹿角中主要蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與種類確認(rèn)，可以明確鹿角的主要蛋白質(zhì)組成。試驗(yàn)中采用蛋白變性溶液對鹿角進(jìn)行處理，再用胰蛋白酶酶解，然后通過超高效液相-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行多肽分離及質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，最后選擇目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到鹿角中蛋白質(zhì)及多肽的信息[10]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀Ultimate 3000聯(lián)用Fusion-Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀(Thermo 公司)，XSE205電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料 Millipore 10 K超濾管；胰蛋白酶(Sigma公司，批號：SLBG6452V)；馬鹿角、梅花鹿角[安國藥材市場王兵要鹿茸鋪提供，產(chǎn)地為黑龍江省伊春市，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)彭艷麗教授鑒定，分別為鹿科動(dòng)物馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)和梅花鹿(CervusNipponTemminck)已骨化的角，編號分別為DWY-MLJ-03和DWY-MHLJ-03]；鹽酸胍、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA二鈉)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氫銨均為分析純；甲酸、乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取鹿角粉碎成細(xì)粉(過五號篩)，精密稱取20 mg，加2 mL蛋白質(zhì)變性溶液(含6 mol·L-1鹽酸胍、1 mol·L-1Tris和2 mmol·L-1EDTA二鈉)，加0.05 mL的 0.5 mol·L-1DTT溶液，置于90 ℃保溫處理4 h，取出，放冷至室溫。加入0.12 mL的0.55 mol·L-1IAA溶液，搖勻，避光反應(yīng)30 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液0.2 mL置于10 k超濾管中，反復(fù)離心洗滌，截留物加0.2 mL的1%碳酸氫銨溶液和5 μL胰蛋白酶溶液(10 mg· mL-1)，置于37 ℃酶解12 h，0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.2 超高效液相色譜條件 色譜柱為Thermo Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，3 μm)，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1，進(jìn)樣量為5 μL，流速0.3 mL·min-1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

2.3 高分辨質(zhì)譜條件 采用Fusion-Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀，電噴霧離子源(ESI+)，噴霧電壓為3.5 kV，霧化溫度350 ℃，離子傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃，S-Lens傳輸效率設(shè)置為60%。一級質(zhì)譜采用Orbitrap作為質(zhì)量分析器，分辨率為120 000(m/z400)，采集范圍為350～1 550 Th，RFLens設(shè)為60%，Mass Tolerance設(shè)為10 ppm；二級質(zhì)譜采用離子阱作為質(zhì)量分析器，分辨率為30 000(m/z400)，F(xiàn)irst Mass(m/z)為100，采用Rapid Scan模式進(jìn)行掃描，HCD碎裂模式，碎裂能量設(shè)置為40%。

2.4 數(shù)據(jù)采集 按上述色譜和質(zhì)譜條件，對供試品溶液進(jìn)行分析，總離子流圖見圖1。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法 目前沒有鹿角完整的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，為鑒定出盡可能多的蛋白質(zhì)，選擇Deer(鹿)以及Colleagn(膠原蛋白)和Keratin(角蛋白)組成的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫Deer+Colleagn+Keratin(截止到2019-03-21)。經(jīng)對該組合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，該庫含有鹿科所有動(dòng)物及近源動(dòng)物的已知蛋白，蛋白種類非常豐富，能滿足研究需要。利用蛋白質(zhì)解析軟件PEAKS Studio 8.5來處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，為鑒定出盡可能多的已知多肽，必須進(jìn)行合理的參數(shù)設(shè)置，軟件參數(shù)設(shè)置如下：-10lgP(Peptide)≥20、-10lgP(Protein)≥20、 FDR(Peptide-Spectrum Matches)=0.4%、Ascore(Post-translational modification of Peptide)≥0、Peptide mutation ion intensity≥0%、Proteins unique peptides≥0、ALC(De novo only)≥50%、FDR為0.4%，設(shè)定無論氨基酸是否修飾還是變異全部進(jìn)行檢測。

A.馬鹿角；B.梅花鹿角圖1 UPLC-HRMS鹿角總離子流圖

3 分析

3.1 總離子流圖(TIC)分析 由圖1可知，馬鹿角和梅花鹿角酶解后多肽的總離子流色譜圖相似度非常高，提示兩者具有相似的多肽組成。目標(biāo)多肽主要在保留時(shí)間75 min之前流出，75 min以后的色譜峰經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)，均為單電荷，為鹿角中非多肽有機(jī)物。

3.2 多肽種類及匹配情況的分析 根據(jù)表2結(jié)果可知，馬鹿角和梅花鹿角鑒定出的多肽種類分別為1 565和1 546種，說明兩者在相同酶解條件下得到的多肽種類數(shù)非常相近。共有多肽數(shù)占已匹配多肽數(shù)兩者均約為50%，扣除酶解過程中產(chǎn)生的不完全酶解多肽或異常斷裂形成的多肽，則馬鹿角和梅花鹿角90%以上的多肽是相同的，可見兩種鹿角多肽組成具有非常高的相似性，與總離子流圖分析結(jié)論相一致。

表2 多肽匹配結(jié)果

3.3 覆蓋度和相對含量top 10蛋白質(zhì)組成的分析 基于蛋白質(zhì)覆蓋度的高低可以明確目標(biāo)物中蛋白質(zhì)的組成。對組成目標(biāo)蛋白質(zhì)的各種多肽響應(yīng)值進(jìn)行累加，可以獲知目標(biāo)物中蛋白質(zhì)的相對含量。覆蓋度top 10的蛋白質(zhì)90%為Ⅰ型膠原蛋白，其中表3中馬鹿角編號1和梅花鹿角編號6蛋白質(zhì)均來自鹿的血液，原因是鹿角由真皮層形成，而真皮層富含血液。相對含量top 10的蛋白全部為Ⅰ型或Ⅱ型膠原蛋白質(zhì)，且兩者70%的蛋白質(zhì)相同。

4 討論

由表3和表4可知，部分蛋白來自非鹿科動(dòng)物體，說明目前對鹿角的蛋白組成研究不充分，鹿角中很多蛋白沒有被發(fā)現(xiàn)鑒定，更進(jìn)一步說明本研究具有必要性。試驗(yàn)中曾嘗試僅用Deer蛋白庫，結(jié)果蛋白覆蓋度較低，top 10中蛋白有9個(gè)覆蓋度不足65%，鑒定出的蛋白種類較少。而采用Deer+Colleagn+Keratin組合庫，含量較高的蛋白均能進(jìn)行匹配，top 10中蛋白覆蓋度不低于90%，該結(jié)果更有利于分析鹿角中的未知蛋白。

表3 覆蓋度top 10的蛋白質(zhì)組成

表4 相對含量top 10的蛋白質(zhì)組成

鹿角及其炮制品(鹿角膠和鹿角霜)臨床用量非常大，但針對其生物活性成分膠原蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究尚少，本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對馬鹿角和梅花鹿角進(jìn)行了分析，明確了組成梅花鹿角和馬鹿角的主要蛋白質(zhì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者所含蛋白質(zhì)主要為Ⅰ型膠原蛋白，并含少量Ⅱ型膠原蛋白，不含角蛋白。目前自然界存在的膠原蛋白種類有幾十種，其結(jié)構(gòu)和功能各不相同。Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)上的區(qū)別主要是含糖量的不同，Ⅰ型膠原蛋白的含糖量約為1%，而Ⅱ型可高達(dá)10%。Ⅰ型膠原蛋白對骨質(zhì)疏松癥發(fā)生、發(fā)展、以及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，Ⅱ型膠原蛋白能修復(fù)各種關(guān)節(jié)損傷，提示鹿角所具有的強(qiáng)筋骨的功能可能與其所含豐富的Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白密切相關(guān)。該研究可為進(jìn)一步開發(fā)利用鹿角蛋白質(zhì)提供有效的技術(shù)支持。該研究下一步將分離純化上述目標(biāo)蛋白質(zhì)，以進(jìn)一步明確鹿角中膠原蛋白質(zhì)與中醫(yī)臨床療效之間的聯(lián)系。