HPLC法測定消栓通絡片中3種三七成分的含量

張桂英,許崇德,劉建芳，牛家豐

(1.日照市人民醫院，山東 日照 276800；2.棗莊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 棗莊 277299)

消栓通絡片是一個純中藥制劑，為現行藥典收載藥品，由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七等11味中草藥組成，具有活血化瘀、溫經通絡的作用，用于瘀血阻絡所致的中風，癥見神情呆滯、言語謇澀、手足發涼、肢體疼痛、缺血性中風及高脂血癥見上述證候者?，F行藥典對該藥的質量控制以薄層層析鑒別為主，主要鑒別了復方中的三七(3種皂苷)、黃芪(黃芪甲苷)、槐花(蘆丁)的成分，僅利用高效液相色譜(HPLC)法對三七中含量最高的人參皂苷Rg1一種成分進行了定量檢測[1-3]。三七(Panaxnotoginseng)為五加科人參屬植物，具有散瘀止血，消腫止痛的功效，常用于抗炎、抗心律失常與抗血栓，活性成分為三七皂苷類化合物[1,4-5]。由于三七為消栓通絡片中一味用量比較大的中草藥，且為貴細藥材，應該對其進行比較全面的質量控制。我們利用HPLC建立了對消栓通絡片中三七的3種主要成分(人參皂苷Rb1、Rg1與三七皂苷R1)進行含量檢測的方法，并對不同生產廠家的藥品進行了質量檢測，比較它們之間的含量差別，同時檢測了藥品中是否非法添加三七莖葉提取物的情況。

1 試驗材料與儀器

1.1 藥品與試劑 消栓通絡片為從藥店自購藥品；人參皂苷Rb1(批號：20170601)、人參皂苷Rg1(批號：20170214)、三七皂苷R1(批號：20161121)為壇墨質檢-國家標準物質中心生產；三七莖葉提取物(西安沃森生物科技有限公司，總皂苷含量80%，批號：20170218)；正丁醇(天津市富宇精細化工有限公司，批號：20181118)、甲醇(天津市富宇精細化工有限公司，批號：20190130)為分析純；乙腈為色譜純(TEDIA,批號:20015013)；娃哈哈純凈水(批號：20190216)。

1.2 主要儀器設備 KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);安捷倫1200液相色譜儀(美國Agilent公司)。色譜柱:InertSustain C18色譜柱(日本GL Sciences Lnc.)。

2 試驗方法

2.1 色譜條件 柱溫25 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長為203 nm；流動相以乙腈為流動相A，以水溶液為流動相B，按照表1的比例變化進行梯度洗脫。

表1 流動相的梯度變化

2.2 樣品溶液的制備 消栓通絡片樣品溶液的制備：消栓通絡片去除外層包衣或薄膜衣，干燥，研磨成粉末，過60目篩，取粉末2.0 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入25 mL乙醚，超聲處理20 min，經濾紙過濾，棄去濾液，殘渣待揮去乙醚干燥后再以水飽和的正丁醇25 mL浸泡6 h，然后超聲處理20 min，過濾，殘渣再以10 mL水飽和的正丁醇洗滌，過濾，兩次濾液合并，再以氨試液進行萃取兩次，每次30 mL，正丁醇萃取液合并，水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，溶液再以0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

藥材對照品溶液的制備：稱取經過60目篩的三七藥材對照品與三七莖葉提取物粉末0.5 g，按照消栓通絡片樣品溶液的制備方法進行處理，即得。

消栓通絡片三七陰性對照溶液的制備：按照藥材組方的比例，取缺少三七的另外10種藥材，按照消栓通絡片的制備方法進行制備，稱取2.0 g，按照消栓通絡片樣品溶液的制備方法進行處理，即得。

3種對照品溶液的制備：分別稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對照品5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，再以甲醇溶液定容，搖勻，備用。

2.3 系統適用性試驗 取對照品溶液、供試品(樣品4，批號：170302)、三七陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb13種對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，以甲醇稀釋至10 mL，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.5 精密度試驗 按“2.1”項下色譜條件，分別精密吸取濃度為0.102 mg·mL-1的三七皂苷R1、0.104 mg·mL-1的人參皂苷Rg1、0.102 mg·mL-1的人參皂苷Rb1對照品溶液各10 μL，連續重復進樣5 次，記錄3個對照品的峰面積。

2.6 重復性試驗 取消栓通絡片粉末(樣品4，批號：170302)約2 g，精密稱重，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按色譜條件檢測，精密吸取供試品溶液10 μL，注入色譜儀，共進樣5次，記錄3個對照品的峰面積。

2.7 穩定性試驗 取消栓通絡片粉末(樣品4，批號：170302)約2 g，精密稱重，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按色譜條件，精密吸取供試品溶液 10 μL，分別在0、4、8、12、16、24 h 進樣，記錄3個對照品的峰面積。

2.8 回收率試驗 取6份已知含量的消栓通絡片粉末(樣品4，批號：170302)約2 g，精密稱重，分別加入編號1～6 的25 mL容量瓶中，精密吸取三七皂苷R10.101 mg、人參皂苷Rg10.102 mg、人參皂苷Rb1對照品0.101 mg，按供試樣品溶液制備方法，依色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率。

3 試驗結果

3.1 系統適用性試驗 按“2.1”項下色譜條件測定，典型的色譜圖見圖1～4。

1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1圖1 3種三七皂苷對照品的色譜圖

圖2 消栓通絡片樣品的色譜圖

圖3 三七莖葉提取物的色譜圖

圖4 消栓通絡片三七陰性對照溶液的色譜圖

3.2 線性關系考察 根據試驗色譜圖(見圖1)，以峰面積值為縱坐標(Y)，進樣濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，計算回歸方程。三七皂苷R1Y=6 000.68X+210.61，r=0.999 6；人參皂苷Rg1Y=7 818.54X+ 191.23，r=0.999 7；人參皂苷Rb1Y= 5 348.27X+207.05，r=0.999 7。結果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1分別在0.025～0.51、0.026～0.52、0.025～0.51 mg·mL-1的范圍內與峰面積呈良好線性關系。

3.3 精密度試驗 根據試驗色譜圖，記錄3個對照品的峰面積，RSD分別為2.28%、1.39%、1.83%(n=5)，說明儀器的精密度良好。

3.4 重復性試驗 根據試驗色譜圖，記錄3個對照品的峰面積，RSD分別為1.84%、2.03%、1.91%(n=5)。結果表明，本方法重復性良好。

3.5 穩定性試驗 根據試驗色譜圖，記錄3個對照品的峰面積，RSD分別為1.73%、2.15%、1.83%(n=6)。結果表明，供試品溶液在24 h 內基本穩定。

3.6 回收率試驗 依色譜條件測定，記錄色譜圖及峰面積，計算回收率。結果平均回收率分別為100.51%、99.68%、98.12%，RSD分別為2.16%、2.01%、2.87%(n=6)。

3.7 樣品含量測定結果 按照前文建立的測定方法，對本次自購的6個生產廠家共計12個生產批次的消栓通絡片中三七皂苷的含量進行了測定，結果見表2。

表2 消栓通絡片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量

4 討論

在進行HPLC分離時，本論文參閱了藥典對三七藥材和含有三七的中成藥對三七皂苷的HPLC檢測條件[1,6-8]，發現它們的出峰時間比較長，我們對色譜條件進行了改變，縮短了出峰時間，指標成分的色譜峰之間無干擾、專屬性、分離度及穩定性也比較好，符合質量檢測的要求。

對6個生產廠家共計12個生產批次的消栓通絡片中三七皂苷的檢測結果進行分析，發現被檢測的消栓通絡片中3種三七皂苷類成分都有明顯的HPLC色譜峰出現，且沒有明顯的三七莖葉提取物的HPLC色譜峰，說明被抽檢的藥品沒有以三七莖葉提取物代替三七根入藥的非法添加情況(三七莖葉提取物在25 min后出現比較明顯的色譜峰，但消栓通絡片樣品中這些色譜峰不明顯，見圖2～3)[9-10]。對不同企業、不同生產批次產品的結果進行比較，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量大都穩定在1.11～1.54 mg·g-1(平均值為1.35 mg·g-1)、5.85～8.31 mg·g-1(平均值為7.08 mg·g-1)、2.92～4.41 mg·g-1(平均值為3.46 mg·g-1)，不同企業藥品之間三七總皂苷的含量整體比較穩定，含量差別不是非常明顯。