硫辛酸注射液熱原反應因素實驗研究

田恩圣，潘春芬，田雨陽，戴曉莉，張君茹

(1.山東省食品藥品審評查驗中心，山東 濟南 250014；2.淄博市市級機關醫院，山東 淄博 255000；3.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢430000；4.山東省藥學科學院，山東 濟南 250100)

熱原反應是注射劑經常出現的不良反應，危害極大，可引起人體發熱、惡心、嘔吐等反應，嚴重者也導致休克甚至死亡[1]。藥品質量標準中用鱟試劑或者兔法進行檢驗。本文對有疑似熱原反應較多的硫辛酸注射液，通過設計毒理試驗，研究引發熱原反應的因素，為生產該品種的企業提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 WRY-C熱原測溫儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；SC-3012低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)； SSW-600-2S型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅)；754N紫外分光光度計(上海精科分析儀器廠)；紫外可見分光光度計UV7(梅特勒-托利多國際有限公司)；TAL-40D型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司)。

1.2 藥品與試劑 鱟試劑(批號:1708230，湛江博康生物有限公司)；內毒素標準品(批號:150601-201783，中國食品藥品檢定研究院)；硫辛酸實驗樣品(國內某企業)；硫辛酸注射液對照樣品(國內某企業)；游離血紅蛋白檢測試劑盒(批號：171205，北京百奧萊博科技有限公司)。

1.3 實驗動物及環境 新西蘭兔16只，普通級，2.2～2.5 kg，由濟南西嶺角養殖繁育中心提供，生產許可證號：SCXK(魯)20150001。飼養溫度20～25 ℃，日溫差≤5 ℃，濕度40%～70%，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。

2 方法

2.1 熱原試驗[2]參考《中國藥典》2020年版(四部)中的熱原檢查法進行。取篩選合格的新西蘭兔6只，分為硫辛酸注射液實驗組和硫辛酸注射液對照品組。測定其正常體溫后15 min以內，自耳靜脈緩緩注入溫熱至約38 ℃的硫辛酸注射液30 mg·kg-1，給藥體積為1 mL·kg-1。然后每隔30 min按測量其體溫1次，共測6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度(℃)。如3只試驗兔中有1只體溫升高0.6 ℃或高于0.6 ℃，或3只試驗兔體溫升高的總和達1.3 ℃或高于1.3 ℃，應另取5只試驗兔復試，檢查方法同上。

2.2 內毒素檢查[2-3]內毒素限值：≤0.25 EU·mg-1(實驗用樣品)，≤0.4 EU·mg-1(國內某企業對照樣品)，采用《中國藥典》2015年版細菌內毒素檢查法檢驗，先計算最大稀釋倍數MVD(MVD=CL/λ)，將供試品按照最大稀釋倍數稀釋制成2支供試品管和2支供試品陽性對照(用該濃度的供試品稀釋液將內毒素標準品制成2λ濃度)，另取2支加入細菌內毒素檢查用水作為陰性對照，2支加入2λ濃度的內毒素標準溶液作為陽性對照，將各管按照標準要求，保溫(60±2)min后，觀察并記錄結果。

2.3 體外溶血試驗[4-5]采用2%新西蘭兔紅細胞懸液為實驗系統，硫辛酸注射液配制成30 mg·mL-1溶液，0.9%氯化鈉注射液為陰性對照，注射用水為陽性對照。2%紅細胞懸液的制備，供試液、紅細胞懸液、生理鹽水的加入方法均按2015年版藥典方法進行，計算溶血率：用分光光度計法用0.9%氯化鈉注射液調零后，于545 nm波長處測定供試品及對照品各管上清液吸收度，A為供試品各管上清液吸收度，B為0.9%氯化鈉注射液對照管上清液吸收度，C為滅菌注射用水管上清液吸收度。

溶血率(%)=(A-B)/(C-B)×100%

2.4 體內溶血試驗[6]采用新西蘭兔6只進行試驗，靜脈注射給藥，劑量為30 mg·kg-1，給藥濃度30 mg·mL-1，給藥容積為1 mL·kg-1，給藥1次。藥前、藥后2 h分別兔耳中動脈采血約2 mL，置于含有EDTAK2的抗凝管中，離心后分離血漿，測定血漿中游離血紅蛋白(FHB)含量。

3 結果

3.1 熱原檢查結果 結果顯示，實驗組硫辛酸注射液在30 mg·kg-1劑量下，第一次試驗的3只兔體溫升高均超過0.6 ℃，復檢的5只兔體溫升高亦均超過0.6 ℃，判斷熱原反應為陽性，而硫辛酸注射液對照組3只新西蘭兔體溫升高值均小于0.6 ℃，熱原反應為陰性，結果見表1～2。

表1 硫辛酸注射液第一次熱原檢查結果

表2 硫辛酸注射液第二次熱原檢查結果

3.2 細菌內毒素結果 結果顯示，實驗組硫辛酸注射液和對照品細菌內毒素檢查結果均為陰性，內毒素含量符合要求，結果見表3。

表3 硫辛酸注射液內毒素檢查結果

3.3 體外溶血試驗結果 結果顯示，實驗組硫辛酸注射液在30 mg·mL-1濃度下，加樣0.3 mL后溶血率大于5%，有明顯的溶血反應發生，結果為陽性，而對照硫辛酸注射液溶血率小于5%，結果為陰性。結果見表4。

表4 硫辛酸注射液體外溶血試驗結果

3.4 體內溶血試驗結果 給藥前比較，給藥后實驗組硫辛酸注射液組兔血漿中游離血紅蛋白含量顯著升高(P<0.01)，而硫辛酸對照組兔血漿中游離血紅蛋白含量變化不明顯(P>0.05)。說明實驗組硫辛酸注射液可引起新西蘭兔體內溶血作用，結果見表5。

表5 硫辛酸注射液體內溶血試驗結果

4 討論

臨床上熱原反應較為常見，引發人體產生熱原反應的物質為致熱源，也就是導致機體發熱的源頭物質。致熱源包括外源性致熱源和內源性致熱源兩大類。外源性致熱源(exogenous pyrogen)種類甚多，而注射中最主要的致熱源為細菌內毒素[7-8]。藥品質量標準中熱原檢查通過鱟試劑法或兔法很容易即可判斷。本實驗對實驗組硫辛酸注射液進行了兔法檢查熱原反應，結果為陽性，而鱟試劑法檢查熱原反應，結果為陰性，故分析熱原反應并非內毒素引起，而有其他致熱源引起。為了進一步探討引起熱原反應的原因，進一步開展了溶血試驗。

體外溶血試驗結果顯示，實驗組硫辛酸注射液在30 mg·mL-1濃度下，會引起兔紅細胞溶血反應，為了進一步驗證體內是否溶血，本文采用了新西蘭兔給予30 mg·kg-1劑量開展了體內溶血試驗，通過檢測血漿中游離血紅蛋白含量反應是否存在溶血[9]。實驗結果顯示，給藥后2 h，血漿中游離血紅蛋白含量較給藥前顯著升高，說明存在明顯的溶血反應。結合體內外溶血和熱原反應試驗結果，分析實驗組硫辛酸注射液熱原反應陽性的可能原因為藥品本身引發紅細胞破裂，導致嚴重溶血，同時對其他細胞也可能存在破壞作用，釋放激素和(或)細胞因子等內熱原，導致機體體溫升高[9]。通過本研究可提示藥品出現熱原反應陽性時，未必是細菌內毒素超標，也可能是溶血等其他因素所致，應多方面查找原因，以便于發現問題，解決問題，保障臨床用藥安全。