瑤藥多穗柯提取物對糖尿病大鼠基質金屬蛋白酶8、9的影響作用研究

鄧聿胤，王麗，呂紀華，劉瑛，覃良，葉銀斯，洪芷琴

(1.廣西壯族自治區中醫藥研究院/廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西壯族自治區 南寧 530022；2.柳州市紅十字會醫院，廣西壯族自治區 柳州 545000；3.桂林醫學院，廣西壯族自治區 桂林 541004)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由遺傳、環境等因素聯合引起的以糖代謝紊亂為重要表現的一種代謝綜合征，其主要表現為多飲、多食、多尿、體重減少及疲乏無力等，嚴重者甚至出現糖尿病酮癥酸中毒，影響患者生命健康。據統計，目前全球約有3.47億糖尿病患者，到2030年可能增加到4.39億，我國2型糖尿病患病率上升至11.2%[1-3]，持續增長趨勢使糖尿病成為全球重大公共衛生問題之一，尋找安全有效的降糖藥物是目前亟待解決的關鍵問題。多穗柯為殼斗科植物木姜葉柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance)Chun.]的干燥葉[4]，主要分布于廣西百色、凌云、河池等地，是廣西傳統壯瑤藥。民間用于治療糖尿病、肺熱咳嗽、咽炎、心腦血管等疾病，具有清熱利尿、滋潤肝腎之功效。本文以降血糖功效為切入點，觀察多穗柯水提物對糖尿病大鼠胰島素(INS)、糖化血紅蛋白(GHbA1c)、基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)及基質金屬蛋白酶-9(MMP-8)的影響作用，為多穗柯降糖藥物的研制提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠，雌雄各半，SPF級，體重(200±20)g ，均購自廣西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK桂2014-0002。實驗動物適應性飼養1周后用于實驗，飼養環境：溫度20～25 ℃，相對濕度60%±10%，自由飲食，實驗動物使用許可證號：SYXK桂2016-0006。

1.2 藥物 多穗柯葉，采自廣西巴馬市，經廣西壯族自治區中醫藥研究院制劑中心饒偉源主任藥師鑒定為殼斗科植物木姜葉柯[Lithocarpuslitseifolius(Hance)Chun.]后使用。四氧嘧啶(Sigma公司，批號：BCBR9198V)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，批號：WXBC8740V)；鹽酸二甲雙胍片(北京京豐制藥集團，批號：180617)。

1.3 主要試劑 枸櫞酸鹽緩沖液(博士德生物工程有限公司，批號：12D10B24)；大鼠胰島素(INS)、糖化血紅蛋白(GHbA1c)、基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)ELISA檢測試劑盒均購自天津安諾瑞康生物技術有限公司，批號分別為358190226、603190226、420180424、425180424；美迪信血糖試紙(天津億朋醫療器械股份有限公司，批號：SSL20Z2D1)。

1.4 主要儀器 TDL-5-A低速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)；Multiskan Go全波長全自動多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯)；美迪信血糖儀(天津億朋醫療器械股份有限公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 糖尿病大鼠模型制備[5]選取健康成年SD大鼠80只，雌雄各半，體重(200±20)g，適應性飼養1周后，隨機分為正常組10只和模型組70只，正常組給予基礎飼料喂養，模型組給予高脂飼料(基礎飼料60.4%+豬油10%+蛋黃粉8%+膽固醇1.5%+蔗糖20%+膽酸鈉0.1%)喂養，共4周。4周后所有大鼠禁食不禁水 12 h，模型組給予腹腔注射STZ 40 mg·kg-1(枸櫞酸鈉緩沖液配制)，正常組給予等體積枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后剪尾采血測隨機血糖，如果造模前血糖<8.9 mmol·L-1，造模后血糖≥16.7 mmol·L-1，體重明顯下降者即為造模成功。成模大鼠以正常飼料繼續喂養1周，測定血糖穩定后用于后續實驗。

1.5.2 多穗柯提取物制備 取多穗柯葉5 kg，切碎加10倍水煎煮2次，第一次1.5 h，第二次1 h，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.25(60 ℃)的清膏，得到多穗柯水提物，每克清膏含2.7 g生藥。灌胃時按照相應劑量配制成相應藥液使用。

1.5.3 分組給藥 選取糖尿病造模成功血糖穩定大鼠50只，隨機分為模型組、二甲雙胍組(Met)、多穗柯水提物(DSK)高、中、低劑量組，每組10只。各組大鼠于分組次日開始灌胃給藥，DSK高、中、低劑量組給藥劑量分別為7、3.5、1.75 g生藥/kg，Met組給藥劑量為0.233 g·kg-1，給藥體積10 mL·kg-1，正常組及模型組給予等體積蒸餾水，每天1次，連續4周。

1.5.4 指標檢測 末次給藥后禁食不禁水12 h，各組大鼠測定體重，水合氯醛腹腔注射麻醉，剪尾采血測定空腹血糖，腹主動脈采血，離心取血清(3 000 r·min-1離心10 min，離心半徑15 cm)后，應用ELISA法檢測血清INS、GHbA1c、MMP-8及MMP-9水平。大鼠取血后處死，取胰腺組織，10%甲醛固定，脫水，常規石蠟包埋，切片，HE染色，進行組織學評價。

2 結果

2.1 多穗柯對糖尿病大鼠體重和空腹血糖的影響 與正常組比較，模型組大鼠體重顯著降低，空腹血糖顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，多穗柯中劑量組和二甲雙胍組給藥4周后大鼠體重明顯增加，多穗柯高、中劑量組及二甲雙胍組給藥4周后大鼠空腹血糖明顯降低(P<0.05)，提示多穗柯水提物可以顯著增加糖尿病大鼠的體重，降低糖尿病大鼠的空腹血糖(見圖1～2)。

圖1 各組大鼠體重水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

2.2 多穗柯對糖尿病大鼠血清INS、GHbA1c的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清INS水平顯著降低，血清GHbA1c水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，多穗柯高、中劑量組和二甲雙胍組大鼠血清INS水平顯著升高，血清GHbA1c水平顯著降低(P<0.05)，提示多穗柯水提物可以提高糖尿病大鼠胰島素分泌，調控糖化血紅蛋白水平(見圖3～4)。

圖2 各組大鼠空腹血糖水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

圖3 各組大鼠血清INS水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

2.3 多穗柯對糖尿病大鼠血清MMP-8、MMP-9的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-8、MMP-9水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，多穗柯高、中、低劑量組和二甲雙胍組大鼠血清MMP-9水平均顯著降低，二甲雙胍組大鼠血清MMP-8水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，多穗柯各劑量組大鼠血清MMP-8水平有下降趨勢，但無統計學差異(P>0.05)。提示多穗柯水提物可以調節糖尿病大鼠血清MMP-9水平(見圖5～6)。

圖4 各組大鼠血清GHbA1c水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

圖5 各組大鼠血清MMP-8水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

圖6 各組大鼠血清MMP-9水平比較 注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

2.4 多穗柯對糖尿病大鼠胰腺組織的影響 鏡下顯示：正常組大鼠胰腺組織結構正常，胰島為圓形或橢圓形，細胞輪廓規則整齊；模型組大鼠胰腺組織結構紊亂，胰島細胞萎縮，輪廓不規則，排列紊亂，有脂肪病變；與模型組比較，多穗柯高、中、低劑量組和二甲雙胍組大鼠胰腺組織病理病變明顯減輕(見圖7)。

A.正常組;B.模型組;C.Met(0.233 g·kg-1);D.DSK(7 g·kg-1);E.DSK(3.5 g·kg-1);F.DSK(3.5 g·kg-1)圖7 各組大鼠胰腺組織病理(HE×200)

3 討論

糖尿病是以慢性高血糖為主的內分泌代謝疾病，其病理機制以胰島素抵抗為主，伴胰島素分泌明顯缺陷或胰島素相對不足從而產生胰島素抵抗障礙[6]。糖尿病的治療目前主要集中在兩個方向：一是通過肌注胰島素合成制劑來降低血糖；二是通過口服降糖藥物來降低血糖。臨床應用廣泛的口服降糖藥主要是雙胍類和磺脲類，需結合年齡、病程、肝腎功能狀況等多方面因素指導使用，使用不當或長期服用均會產生低血糖、胃腸道反應等副作用[7-9]。因此，尋找療效確切、副作用小、安全穩定的口服降糖藥仍是糖尿病藥物研究的主要方向。

胰島素是由胰島β細胞產生的內分泌激素，能夠調節機體血糖、加速葡萄糖的攝取和利用，是反映胰島素細胞貯備和分泌功能的重要指標。在長期高脂狀態下，胰島分泌胰島素代償性增加，使胰島功能逐漸衰竭，從而導致胰島素分泌降低，葡萄糖攝取和利用減少從而使機體血糖升高。糖化血紅蛋白在機體中通過持續、緩慢且不可逆的糖化反應形成，是紅細胞中血紅蛋白與血清中糖類相結合的產物，血糖濃度及血糖與血紅蛋白接觸的時間均能夠影響糖化血紅蛋白的含量，《中國2型糖尿病防治指南(2020年版)》將“糖化血紅蛋白”首次正式納入糖尿病診斷標準中[10-11]。因此，胰島素與糖化血紅蛋白均可作為評價降糖藥物作用的重要指標。本研究中多穗柯能夠顯著提高糖尿病大鼠胰島素分泌水平，降低血清糖化血紅蛋白含量，改善胰腺組織病變，提示多穗柯能夠提高機體對糖尿病的耐受性，改善胰島功能，促進胰島素分泌，調控糖化血紅蛋白水平，具有降糖效應。

糖尿病病因還與眾多細胞因子和酶活性改變有關，基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類具有類似結構和共同生物化學性質的金屬依賴性蛋白內切酶家族。在2型糖尿病中，高血糖引起的糖基化終末產物積累，及高胰島素血癥導致的ROS和氧化應激增加[19]，均會顯著促進MMPs 的高表達和酶活性增強。MMP-9主要是由中性粒細胞分泌產生的酶，MMP-8是一種多形核細胞的間質膠原酶，研究顯示[12-13]，2型糖尿病患者血清中MMP-9、MMP-8水平均顯著升高，在一定程度上反映了糖尿病早期血管病變，對評估、發現早期糖尿病及糖尿病并發癥意義重大。本研究中糖尿病模型大鼠血清MMP-8、MMP-9水平顯著升高，與文獻報道相符。多穗柯能夠顯著降低糖尿病大鼠血清MMP-9水平，提示多穗柯也許能夠通過調控MMP-9水平干預糖尿病大鼠早期血管病變。

綜上所述，本研究對瑤藥多穗柯降糖作用進行了實驗研究，明確了瑤藥多穗柯具有降糖作用，其機制可能與改善胰島功能，促進胰島素分泌，調控糖化血紅蛋白與MMP-9水平，提高機體對糖尿病的耐受性有關，為多穗柯的開發應用提供了理論依據。但本文僅開展了多穗柯降糖藥效作用研究，其化學成分及作用機制有待進一步深入探討。