白扁豆配方顆粒質(zhì)量標準研究

李素梅，畢曉黎，胥愛麗，李養(yǎng)學，江潔怡，張靖年，李若菲

[1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院）/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東廣州 510095；2.中山大學新華學院，廣東廣州 510520]

白扁豆來源于豆科植物Dolichos lablabL.的干燥成熟種子，在我國分布廣泛，為常用藥食兩用中藥，具有健脾化濕、和中消暑的功能，主要用于治療脾胃虛弱、食欲不振、暑濕吐瀉、大便溏泄、白帶過多等[1]。白扁豆主要含有蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、鐵、鈣、磷、維生素等營養(yǎng)成分[2]，此外還含有甾體、苷類、葫蘆巴堿等成分[3]。研究表明，白扁豆具有抗病毒、抗菌[4]、抗氧化[5-6]、保護缺氧性神經(jīng)細胞的凋亡壞死[7]、防治酒精性肝病[8]等藥理活性。《中國藥典》收載有白扁豆，其質(zhì)量控制僅有性狀、橫切面顯微鑒別、水分檢查，未收載定性定量質(zhì)控指標。目前，白扁豆質(zhì)量控制研究方面的文獻相對較少，僅有白扁豆總磷脂含量測定[9]和白扁豆中哌林可酸定性定量研究的報道[10]。

白扁豆配方顆粒是由合格的白扁豆飲片經(jīng)提取、濃縮等現(xiàn)代制劑工藝制備而成的可供臨床直接配方使用的顆粒劑[11]。目前，不同生產(chǎn)企業(yè)白扁豆配方顆粒質(zhì)量標準參差不齊，無統(tǒng)一的標準，多為性狀、浸出物等質(zhì)控指標，缺少定性和含量測定指標，導致臨床療效不能保證。因此，建立白扁豆配方顆粒定性、定量質(zhì)量控制方法顯得十分必要。葫蘆巴堿是白扁豆中所含的兩性季銨鹽類生物堿，具有降血糖、抗腫瘤、降血脂[12-16]、抗感染、抗菌、鎮(zhèn)痛等活性[17]。葫蘆巴堿藥理活性與白扁豆藥理活性具有一定的相似性，本研究選擇其為白扁豆配方顆粒質(zhì)量控制指標，采用白扁豆對照藥材和葫蘆巴堿隨行對照，建立白扁豆配方顆粒薄層色譜定性鑒別方法，采用高效液相色譜法測定白扁豆配方顆粒中葫蘆巴堿的質(zhì)量分數(shù)，旨在為白扁豆質(zhì)量標準的制訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-700DE超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；澳華HH-2恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；DH-9203恒溫電熱烘箱（上海精密實驗設備有限公司）；ATS4卡瑪自動點樣機（瑞士卡瑪公司）；卡瑪成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；TLE-204萬分之一、Mettler XS 205 DU十萬分之一梅特勒電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；1200安捷倫液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）。

1.2 試藥

白扁豆對照藥材（批號：AF 00120351）購自成都埃法生物科技有限公司；葫蘆巴堿（批號：H-057-180110，質(zhì)量分數(shù)：98%）購于成都瑞芬思生物科技有限公司；白扁豆配方顆粒10批：批號8060101（編號S1）、批號0062471（編號S2）、批號0093521（編號S3）、批號9041951（編號S4）、批號0072761（編號S5）、批號0091501（編號S6）、批號9072151（編號S7）、批號9120761（編號S8）、批號0122231（編號S9）、批號9024401（編號S10），均由廣東一方制藥有限公司提供；乙腈為Merck色譜純試劑，液相用水為屈臣氏水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白扁豆配方顆粒定性鑒別

2.1.1 定性鑒別方法Ⅰ取白扁豆配方顆粒0.5 g，研細，加入70%（體積分數(shù)，下同）乙醇30 mL，超聲處理提取30 min，提取液蒸干，殘渣加70%乙醇1 mL溶解，制得供試品溶液。另取白扁豆對照藥材1.00 g，置250 mL燒杯中，加100 mL水，加熱煎煮使之保持微沸30 min，放冷后濾過，濾液置水浴鍋上蒸至剩約5 mL，用適量硅藻土吸附，蒸干并轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，自“加入70%乙醇30 mL”起，同法制得白扁豆對照藥材溶液。按照《中國藥典》四部通則0502項下薄層色譜法操作，吸取上述供試品溶液2 μL、白扁豆對照藥材溶液4 μL，分別點樣在同一硅膠G薄層板，以正丁醇-冰醋酸-水（體積比19∶5∶5）作為展開劑[1]，展開，取出晾干后，以茚三酮試液為顯色劑，在105℃烘箱中加熱使斑點顯色清晰，結(jié)果見圖1。可見，供試品色譜中，在與白扁豆對照藥材色譜相同Rf值位置處，顯相同顏色的斑點，10批配方顆粒TLC鑒別均可檢出對應斑點。

圖1 10批白扁豆配方顆粒薄層鑒別圖Figure 1 TLC of ten batches of Lablab Semen Album granules

2.1.2 定性鑒別方法Ⅱ 取白扁豆配方顆粒0.20 g，研細，加30 mL甲醇，超聲處理提取30 min，提取液蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，制得供試品溶液。另取白扁豆對照藥材2.00 g，加30 mL甲醇，同法制得白扁豆對照藥材溶液。再取葫蘆巴堿對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。

按照《中國藥典》四部通則0502項下薄層色譜法操作，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于在同一硅膠GF254薄層板上，以正丁醇-甲醇-水（體積比4∶2∶4）作為展開劑展開，取出晾干后，在波長為254 mm的紫外光燈下檢視，結(jié)果見圖2。可見，供試品色譜中，在與白扁豆對照藥材和葫蘆巴堿對照品色譜相同Rf值位置處，顯相同顏色的斑點，10批配方顆粒TLC鑒別均可檢出對應斑點。

圖2 10批白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿薄層鑒別圖Figure 2 TLC of ten batches of Trigonelline of Lablab Semen Album granules

2.2 葫蘆巴堿質(zhì)量分數(shù)的測定

2.2.1 色譜條件 以GRACE Econosphere Amino柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，柱溫為25℃，以乙腈-水（體積比80∶20）為流動相[18-19]，流速為1 mL/min，檢測波長為265 nm。

2.2.2 葫蘆巴堿對照品儲備液的配制 精密稱取葫蘆巴堿對照品5.24 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度線，制成質(zhì)量濃度為0.205 4 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取白扁豆配方顆粒適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加25 mL 70%甲醇溶液為提取溶劑，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，取出放冷后，補足質(zhì)量，搖勻并濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 專屬性試驗 分別取空白溶劑、葫蘆巴堿對照品溶液、供試品溶液，進樣10 μL，按照“2.2.1”項色譜條件測定，采集色譜圖，結(jié)果見圖3。可見，空白溶劑對葫蘆巴堿的測定無干擾，具有較好的專屬性。

圖3 白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿測定的HPLC圖Figure 3 HPLC of content of trigonelline in Lablab Semen Album granules.

2.2.4.2 葫蘆巴堿線性考察 取“2.2.2”項的葫蘆巴堿對照品儲備液，分別精密吸取1、1.5、2.5、5、7.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即制得質(zhì)量濃度分別為20.54、30.81、51.35、102.7、154.05 μg/mL的對照品溶液，分別精密吸取已配制的對照品溶液及對照品儲備液（0.205 4 mg/mL）各10 μL，進樣，按照“2.2.1”項色譜條件測定并記錄峰面積，以葫蘆巴堿峰面積為縱坐標（Y）、葫蘆巴堿進樣的量（μg）為橫坐標（X）進行回歸，得回歸方程Y=1 426.212 79X+2.651 1497（r=1.000 0），結(jié)果表明葫蘆巴堿進樣量在0.205 4～2.054 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

2.2.4.3 精密度試驗 精密吸取白扁豆配方顆粒（S1）供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積并計算RSD，結(jié)果葫蘆巴堿色譜峰峰面積RSD值為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取白扁豆配方顆粒（S1）供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣測定峰面積并計算RSD，結(jié)果葫蘆巴堿色譜峰峰面積RSD值為0.48%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.4.5 重復性試驗 取白扁豆配方顆粒（S1），研細，取約0.2 g，精密稱定質(zhì)量，按“2.2.3”項方法平行處理6份，按“2.2.1”項色譜條件測定峰面積并計算質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果葫蘆巴堿平均質(zhì)量分數(shù)為10.00 mg/g，RSD值為0.36%，表明方法重復性較好。

2.2.4.6 中間精密度試驗 由實驗室其他工作人員，在不同時間和儀器上操作，取白扁豆配方顆粒（S1），按“2.2.3”項方法平行處理6份供試品溶液，再按“2.2.1”項色譜條件測定，結(jié)果葫蘆巴堿色譜峰峰面積RSD值為1.42%，表明方法中間精密度良好。

2.2.4.7 加樣回收率試驗 精密稱取葫蘆巴堿對照品12.78 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋定容至刻度線，制得質(zhì)量濃度為0.250 5 mg/mL的對照品溶液；再取9個規(guī)格為100 mL的具塞錐形瓶，編號1～9號，其中1～3號錐形瓶各分別精密加入2 mL對照品溶液，4～6號錐形瓶各分別精密加入4 mL對照品溶液，7～9號錐形瓶各分別精密加入6 mL對照品溶液，置氮吹儀上吹干溶劑后，再取S1（8060101）白扁豆配方顆粒，研細，取約0.1 g，9份，精密稱定，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果測得平均回收率為103.38%（n=9），RSD為0.98%，表明方法回收率良好，結(jié)果見表1。

表1 葫蘆巴堿加樣回收率試驗結(jié)果Table 1 Recovery results of trigonelline(n=9)

2.2.5 白扁豆配方顆粒樣品質(zhì)量分數(shù)的測定 取S1～S10白扁豆配方顆粒，按“2.2.3”項方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項色譜條件測定，10批白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果見表2。可見，10批次白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿平均質(zhì)量分數(shù)為9.38 mg/g，后續(xù)將繼續(xù)收集多批次樣品進行測定，再根據(jù)測定結(jié)果擬定白扁豆配方顆粒中葫蘆巴堿含量限度。

表2 10批次白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果Table 2 Results of content of trigonelline in ten batches of Lablab Semen Album granules(n=2)

3 討論

白扁豆配方顆粒對照藥材定性鑒別主要針對氨基酸類成分進行鑒別，參考了2020年版《中國藥典》一部大豆黃卷鑒別項下亮氨酸鑒別的展開劑及顯色條件，以正丁醇-冰醋酸-水（體積比19∶5∶5）為展開劑，展開晾干后，以茚三酮試液為顯色劑，在105℃加熱，結(jié)果顯示供試品色譜與白扁豆對照藥材色譜斑點對應良好。葫蘆巴堿薄層色譜鑒別過程中，因葫蘆巴堿為兩性季銨鹽類生物堿，極性較大，展開劑選擇方面往極性大的展開系統(tǒng)考慮，曾嘗試了無水乙醇-丙酮-鹽酸（體積比5∶3∶0.5）展開劑，但是展開效果不好，經(jīng)摸索調(diào)整為正丁醇-甲醇-水系統(tǒng)，比例為正丁醇-甲醇-水（體積比4∶1∶4）時，葫蘆巴堿斑點Rf值較低，經(jīng)調(diào)整為正丁醇-甲醇-水（體積比4∶2∶4），斑點Rf值適中，斑點對應良好；另外，葫蘆巴堿在265 nm下有最大紫外吸收，故采用GF254板為固定相、254 nm為檢視波長，可較好地鑒別葫蘆巴堿斑點。另外，對所建立的薄層色譜鑒別方法進行了耐用性考察，分別考察了自制硅膠G薄層板/自制硅膠GF254薄層板和默克硅膠G預制板（批號：MX98383926）/默克硅膠GF254預制板（批號：MC41365054）、不同溫度（25℃、4℃）、不同濕度（25%、75%）條件下的展開情況，結(jié)果顯示所建方法耐用性均較好。

白扁豆配方顆粒葫蘆巴堿質(zhì)量分數(shù)測定方法研究建立過程中，因葫蘆巴堿極性較強，在一般C18反相柱上吸附較弱，導致出峰較早，故選擇氨基鍵合柱進行分析。供試品溶液的制備分別考察了不同提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、20%甲醇）、不同提取方式（超聲、加熱回流）、提取溶劑料液比（1∶1、1∶2）、提取時間（15、30、45 min）的葫蘆巴堿提取效果，結(jié)果以70%甲醇25 mL為提取溶劑、超聲處理30 min的提取效果較好。另外，分別考察了不同廠牌色譜柱（Phenomenex Luna NH2柱、GRACE Econosphere Amino柱、Waters Xbridge Amide柱）、以及不用柱溫（20、25、30℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）等色譜耐用性影響因素，綜合考慮色譜峰峰形、分離度、壓力、分析時間等因素，確定最終色譜條件。

本研究建立的白扁豆配方顆粒的定性與定量方法簡便可行、重復性好、準確可靠，可為白扁豆配方顆粒質(zhì)量標準的制訂或標準提高及質(zhì)量控制提供參考。