白細胞介素-35介導p38 MAPK/NF-κB信號對脂多糖誘導的急性肺損傷的保護作用

謝亞玲，劉佳麗，楊麗，陳苗苗

（1.綿陽市中心醫院重癥醫學科，四川綿陽 621000；2.西南醫科大學附屬醫院重癥醫學科，四川瀘州 646000）

急性肺損傷（acute lung injury,ALI）是指由嚴重感染、外傷等原因引起的肺組織內皮細胞、肺泡上皮細胞和肺間質的彌漫性損傷[1-2]。白細胞介素-35（interleukin-35，IL-35）屬于IL-12家族，是由IL-12 p35亞基和EB病毒誘導基因3（epstein-Barr virus inducible gene 3，Ebi3）亞 基 組 成 的 異 二 聚 體[3]。Ebi3是IL-12 p40同源物，也是EB病毒在B淋巴母細胞中誘導產生的睫狀節神經細胞營養因子[4]。IL-12 p35是一種糖蛋白，在人類大部分組織中表達[5]。免疫系統活化的樹突狀細胞、調節性T細胞和調節性B細胞中均具有Ebi3表達和分泌。有研究表明，IL-35主要由Treg細胞限制性分泌，對免疫功能發揮很強的負向調控。絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[6]。研究證實，MAPKs信號傳導通路存在于大多數細胞內，參與細胞生長、分化及凋亡等生物學過程，MAPK主要成員為p38 MAPK，可調節肺部病變炎癥反應、細胞凋亡[7-8]。核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）是調節細胞因子和炎性介質表達的重要轉錄因子，參與機體細胞凋亡和細胞分化、應激及組織損傷等過程中信息傳遞[9]。本研究旨在探討IL-35介導p38MAPK/NF-κB信號通路對LPS誘導的ALI的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級小鼠40只，6～8周齡，體質量22～25 g，購自西南醫科大學，生產許可證號：SCXK（川）2018-17。小鼠飼養于SPF級屏障環境中，自由進食和飲水。所有動物實驗經醫院動物倫理委員會批準并進行。

1.2 試劑與儀器

小鼠肺上皮細胞MLE-12購于上海文韌生物科技有限公司；DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清購于上海中喬新舟生物科技有限公司；空白的pcDNA3.1質粒、表達IL-35的pcDNA3.1質粒購自上海雅吉生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaaa‐haricles,LPS）購于上海吉至生化科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；IL-12a/p35、EB病毒誘導蛋白3（Ebi3）和β-actin單克隆抗體購自上海澤葉生物科技有限公司；Ebi3、IL-35酶聯免疫吸附（enzyme linked im‐munosorbent assay,ELISA）試劑盒購買自欣博盛生物科技公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin6，IL-6）和白細胞介素-1β（interleukin1β,IL-1β）ELISA試劑盒購于上海將來實業股份有限公司；髓過氧化物酶（myelo‐peroxidase，MPO）試劑盒購于上海廣銳生物科技有限公司；Trizol試劑盒購于北京天漠科技開發有限公司；RT-PCR反轉錄試劑盒購于北京智杰方遠科技有限公司。

1.3 細胞培養及轉染

將細胞MLE-12接種至含營養物質的RPMI-1640培養基中，置于37℃充滿5%（φ）CO2培養箱中培養。當細胞覆蓋率達80%時，用PBS清洗2次，胰蛋白酶進行消化，離心棄上清，更換培養基繼續培養。根據Lipofectamine 2000說明書將pcDNA3.1-IL-35（pIL-35）質粒或pIL-35-NC質粒用轉染至細胞中，轉染48 h后收集各組細胞。

1.4 小鼠急性肺損傷模型制備及分組[10]

將40只小鼠隨機分成4組，分別為對照組（轉染pIL-35-NC質粒組）、LPS組、LPS+NC組、LPS+pIL-35組，每組10只。除對照組外，其余組小鼠采用3%（φ）戊巴比妥鈉麻醉小鼠，暴露小鼠氣管后，用注射器緩慢滴加LPS入氣管內，豎立起小鼠，旋轉，使LPS分布均勻，以水柱隨呼吸上下浮動作為插管成功標志，即為建模成功。在成功建模后，對照組給予生理鹽水氣管內滴注。LPS+NC組：模型小鼠經尾靜脈注射轉染pcDNA3.1-NC空載質粒的MLE-12細胞。LPS+pIL-35組：模型小鼠經尾靜脈注射轉染pIL-35質粒的MLE-12細胞。

1.5 肺組織病理變化

取小鼠肺組織，使用4%（φ）多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，參照HE染色試劑盒及TUNEL染色試劑盒說明書的步驟進行染色5～15 min，常規清洗、脫水、封片，置于光學顯微鏡觀察肺部組織學改變，顯微鏡下隨機選擇3～5個視野，于100倍拍照。

1.6 小鼠肺損傷評分

HE染色后觀察肺組織病理學變化并行肺損傷評分，觀察炎性細胞浸潤、肺泡出血、肺水腫、肺泡間隔增寬或透明膜形成4項指標，根據肺損傷嚴重程度分別進行評分（0分：無病變；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變；4分：極重度病變），累計總分為小鼠肺損傷評分。

1.7 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測

將肺組織樣本攪碎勻漿，提取總RNA，逆轉為cDNA后進行熒光定量PCR。PCR引物如下：IL-12a/p35（上 游：5′-CCTTGCACTTCTGAAGAGATTGA-3′，下游：5′-ACAGGGCCATCATAAAAGAGGT-3′）；Ebi3（上游：5′-CAGAGCACATCATCAAGCC-3′，下游：5′-GAGAAGATCTCTGGGAAGGG-3′）；β-action設置為內參（上游：5′-GCAAGAGCACAAGAGG A AGA-3′，下游：5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTC-3′）。采用2-??Ct計算各基因相對表達量。

1.8 肺臟組織樣本采集與處理

采集小鼠肺組織，用PBS沖洗干凈，右肺中葉稱濕質量（wet weight,W），然后在干燥箱中以80℃烘48 h，測定干質量（dryweight,D），以W/D評估肺組織的水腫程度。按照試劑盒說明方法進行測定MPO。

1.9 血清TNF-α、IL-6和IL-1β的檢測

處死小鼠取血清，采用TNF-α、IL-6和IL-1βELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，詳細步驟遵照試劑盒說明書進行。

1.10 肺組織TNF-α、IL-6和IL-1β檢測

取小鼠肺臟組織，加入預冷裂解液行研磨勻漿，以3 000 r/min轉速離心10 min后取上清，?20℃冷藏，采用ELISA法檢測肺臟組織TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.11 Western blot檢測

取小鼠肺臟組織，將組織剪碎后加入RIPA強裂解液裂解，經過離心后測定上清液蛋白濃度。收集好蛋白樣后進行凝膠電泳，過夜孵育一抗后，室溫孵育熒光二抗1 h，用電化學發光法（ECL）于暗室發光。采用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.12 統計學方法

采用SPSS18.0統計軟件分析數據。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩組組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pIL-35預處理后對LPS誘導的ALI小鼠IL-35表達的影響

對照組細胞結構完整，無病理表現；LPS組出現肺泡腔變窄，細胞結構紊亂，細胞浸潤在炎性環境等ALI病理表現。與對照組相比，LPS組IL-12a/p35和Ebi3相對mRNA表達量降低（P<0.05）。與LPS+NC組 相 比，LPS+pIL-35組IL-12a/p35和Ebi3相對mRNA表達量明顯升高（P<0.05）；LPS組和LPS+NC組IL-12a/p35、Ebi3相對mRNA表達量差異無統計學意義（P>0.05）。Western blot實驗結果表明，與對照組相比，LPS組IL-12a/p35、Ebi3蛋白相對表達量明顯降低（P<0.05）。與LPS+NC組相比，LPS+pIL-35組IL-12a/p35、Ebi3蛋白相對表達量明顯增加（P<0.05）。LPS組和LPS+NC組IL-12a/p35、Ebi3蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 pIL-35預處理后對ALI小鼠IL-35表達的影響Figure 1 Effect of pIL-35 pretreatment on the expression of IL-35 in ALI mice

2.2 各組小鼠肺臟組織病理觀察及肺損傷評分

對照組肺臟組織肺泡結構清晰，細胞排列整齊，未見炎癥細胞浸潤，無病理性損傷；LPS組小鼠肺臟組織結構紊亂，肺泡壁增寬增厚，肺間質出現水腫，并伴有大量炎癥細胞浸潤；LPS+pIL-35組肺組織結構較清晰，肺泡壁較模型組更薄，接近對照組。與對照組相比，LPS組小鼠肺組織損傷評分升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織損傷評分明顯下降（P<0.05）。與對照組相比，LPS組小鼠肺組織W/D增大（P<0.05），出現肺水腫；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織W/D明顯減小（P<0.05）。與對照組相比，LPS組MPO水平升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組MPO水平降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠肺臟組織病理觀察Figure 2 Pathological observation of lung tissues of mice in each group

2.3 pIL-35預處理后對LPS誘導的ALI小鼠炎癥因子水平比較

與對照組相比，LPS組小鼠血清炎癥因子TNFα、IL-6和IL-1β水平升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯下降（P<0.05）。與對照組相比，LPS組小鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯下降（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠炎癥因子水平Figure 3 Levels of inflammatory factors in mice in each group

2.4 pIL-35預處理后對LPS誘導的ALI小鼠肺組織凋亡的影響

與對照組相比，LPS組小鼠肺組織凋亡細胞比例明顯增高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織凋亡細胞比例明顯降低（P<0.05）。與對照組相比，LPS組Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表達水平明顯增加，Bcl-2蛋白表達水平明顯減小（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表達水平明顯減少，Bcl-2蛋白表達水平明顯增加（P<0.05）。見圖4。

圖4 pIL-35預處理后對LPS誘導的ALI小鼠肺組織凋亡的影響Figure 4 Effect of pIL-35 pretreatment on lung tissue apoptosis in mice with LPS-induced ALI

2.5 pIL-35預處理后對LPS誘導的ALI小鼠p38MAPK/NF-κB信號通路的影響

與對照組相比，LPS組小鼠肺組織p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表達明顯下降（P<0.05）；而各組間p38、p65、IκB蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義（P<0.05），見圖5。

圖5 pIL-35預處理后對LPS誘導的ALI小鼠p38 MAPK/NF-κB信號通路的影響Figure 5 Effect of pIL-35 pretreatment on p38 MAPK/NF-κB pathway in mice with LPS-induced ALI

3 討論

ALI是造成患者死亡的原因之一，主要的臨床表現是呼吸衰竭和頑固性低氧血癥[11-12]。ALI常見的發病機制是炎性細胞及其釋放的細胞因子介導的炎癥，可導致肺泡腔滲出液體，使肺微血管通透性增高，進一步導致非心源性肺水腫，嚴重影響患者的生活質量，威脅患者的生命健康[13-14]。

本研究結果顯示，經pIL-35預處理后，LPS誘導的ALI小鼠肺臟組織病理損傷有所緩解。與對照組相比，LPS組IL-12a/p35和Ebi3 mRNA和蛋白相對表達量降低，經pIL-35預處理后，IL-12a/p35和Ebi3 mRNA和蛋白相對表達顯著提升。與對照組相比，LPS組小鼠肺組織W/D增大，出現肺水腫；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織W/D明顯減小，肺水腫癥狀有所緩解。與對照組相比，LPS組MPO水平升高；與LPS組相比，LPS+pIL-35組MPO水平降低。結果提示經pIL-35預處理后，緩解了LPS誘導的小鼠肺損傷，減低MPO的含量，緩解炎癥反應。MPO是一種血紅素蛋白，富含于中性粒細胞中，當機體受到外界刺激可釋放MPO到組織液中[15]。MPO能催化氧化氯離子產生次氯酸殺死吞噬細胞中的微生物，破壞多種靶物質，在體內炎癥的產生和調節中發揮作用[16-17]。有研究報道顯示，酵母混懸液誘導小鼠急性肺損傷試驗發現小鼠肺臟MPO活力顯著增強[18]。

本研究結果發現，與對照組相比，LPS組小鼠血清和肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠血清和肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯下降（P<0.05）。結果提示經pIL-35預處理后，減輕了LPS誘導的ALI炎癥反應。炎癥因子的大量釋放是ALI最重要的病理進程，在誘導肺損傷過程中發揮著重要作用。LPS作用于肺組織可誘導巨噬細胞分泌IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子。TNF-α可在炎癥反應起始階段誘導多種炎性因子大量釋放，觸發級聯炎癥反應，進而加重ALI患者機體炎癥刺激[19]。既往研究[20]表明，IL-6、TNF-α和IL-1β炎癥因子在LPS誘導的ALI小鼠中含量增加，經干預后其水平下降，這與本文研究結果一致。

本研究發現，與對照組相比，LPS組肺組織凋亡細胞比例、Bax和cleaved ca/cas3蛋白表達水平明顯增高，Bcl-2蛋白表達水平明顯減小；與LPS組相比，LPS+pIL-35組肺組織凋亡細胞比例、Bax和cleaved cas3/cas3蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高。結果提示，經pIL-35預處理后抑制了LPS誘導的ALI小鼠肺組織細胞凋亡，從而起到保護肺臟器官的作用，其作用機制可能是通過抑制促凋亡蛋白Bax表達和促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達。Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，LPS組小鼠肺組織p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表達明顯升高；與LPS組相比，LPS+pIL-35組小鼠肺組織p-p38/p38、p-p65/p65、p-IκB/IκB蛋白表達明顯下降。該結果提示IL-35調節p38 MAPK/NF-κB通路抑制LPS誘導的急性肺損傷。p38 MAPK對機體炎癥反應和正常免疫有重要影響，參加中性粒細胞及巨噬細胞等功能性反應，同時可對生成的微量干擾素進行調節以調控T細胞分化、凋亡[21]。LPS誘導后肺組織內p38 MAPK被激活，參加炎癥反應與細胞應激、凋亡等多種生物學行為[22]。NF-κB為調控炎癥關鍵環節，有啟動炎癥反應，表達黏附分子、介導單核細胞形成細胞因子等多種生物效應。NF-κB可加速釋放炎癥介質，刺激細胞釋放TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子加重機體炎癥反應。既往研究［23］表明，澤漆醇提取物對LPS誘導小鼠ALI具有保護作用，其機制可能與調控MAPK/NF-κB信號通路有關，這與本文結果類似。

綜上所述，IL-35通過調控p38 MAPK/NF-κB通路，降低LPS誘導ALI小鼠炎癥反應程度，緩解病理損傷，抑制細胞凋亡，對受損肺組織起到保護作用。