Parkin蛋白對(duì)帕金森細(xì)胞模型中α-突觸核蛋白表達(dá)的抑制作用及機(jī)制

胡霞，陳方方，侯蓓蓓，林貞仿，云小琴，孟丹，張力引，黎松林，李嘉鑫，郭春

[1.四川省八一康復(fù)中心（四川省康復(fù)醫(yī)院），四川 成都 611135；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆烏魯木齊 830011]

帕金森疾病（Parkinson's disease,PD）是繼阿爾茨海默病（Alzheimer disease,AD）之后的第二最常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，主要治療手段是利用藥物增加多巴胺在大腦中的濃度或者直接刺激多巴胺受體改善臨床癥狀，但并不能從根本上延緩或抑制帕金森病的發(fā)展，所以探索帕金森病的病因和發(fā)病機(jī)制有著重要的意義。

在帕金森病的研究過(guò)程中，一個(gè)值得關(guān)注的致病基因是Parkin（PARK2），是PD中最為常見(jiàn)的染色體的隱性突變，Parkin基因突變首次由Kitada等發(fā)現(xiàn)跟帕金森病息息相關(guān)[2]。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Parkin基因的缺失，直接影響某些蛋白降解，從而引起多巴胺類(lèi)神經(jīng)元的毒性損傷，導(dǎo)致常染色體隱性少年型帕金森病[3]。研究發(fā)現(xiàn)在正常人的大腦中，尤其在黑質(zhì)致密部Parkin蛋白有豐富表達(dá)，而在PD患者腦內(nèi)缺乏Parkin蛋白的表達(dá)。Parkin蛋白一般在腦中并不是以天然結(jié)構(gòu)的α突觸核蛋白（α-synuclein）為底物將其泛素化，而是通過(guò)對(duì)α-synuclein蛋白翻譯后加工、構(gòu)像改變等結(jié)構(gòu)上發(fā)生作用，致使α-synu‐clein發(fā)生降解。Parkin基因突變致使Parkin蛋白缺失、功能以及酶活性減弱或消失，引起細(xì)胞內(nèi)異常蛋白的堆積，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡，進(jìn)而引發(fā)帕金森病[4-5]。由此可知Parkin蛋白作為一種泛素蛋白的配體，能激活蛋白酶，水解過(guò)多αsynuclein蛋白，對(duì)多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞具有保護(hù)作用。

本研究以Parkin為目的基因構(gòu)建過(guò)表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，擬構(gòu)建Parkin基因過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型，從Parkin基因的調(diào)控角度進(jìn)一步探討6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用基因手段治療PD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 主要試劑PC12細(xì)胞購(gòu)自廣州輝園苑有限公司；6-OHDA、MEM培養(yǎng)液、DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、LB培養(yǎng)基和Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Sigma公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)于全式金有限公司；Bax、α-synuclein、Parkin和β-actin蛋白抗體購(gòu)于abcam；氨芐青霉素和所有qPCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2 主要儀器HCB-1300V超凈工作臺(tái)（海爾A2生物）；5920R低溫離心機(jī)（Eppendor，德國(guó)）；Lepgen-96 PCR基因擴(kuò)增儀（ABI公司，美國(guó)）；1658001瓊脂糖水平電泳槽（BIO-RAD）；XJL-20/XJL-20BD普通光學(xué)顯微鏡（粵顯，中國(guó)）；HR1500-II生物安全柜（Thermo，美國(guó)）；DSPM-508水套式CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞采用高糖DMED培養(yǎng)液加10%（φ）新生牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及1%L-谷氨酰胺中培養(yǎng)。

1.2.2 6 -OHDA誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型建立[8]PC12細(xì)胞在37℃5%（φ）CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%~90%，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代至3代進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL完全DMEM培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h，用含2%血清的DMEM培養(yǎng)基配置不同濃度（1~1 000 μmol/L）的6-OHDA溶液處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸掉細(xì)胞上清液，在每孔加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm處測(cè)量各孔的吸光度（A），同時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基設(shè)置調(diào)零孔，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建、搖菌及質(zhì)粒提取 通過(guò)PCR方法擴(kuò)增人Parkin基因（NM-004562）序列，將目的條帶切割后純化送至上海生工生物工程股份有限公司鑒定序列是否正確，同時(shí)將空骨架載體pLVSO2進(jìn)行NheI和SalI雙酶切，純化回收大片段。用T4 DNA連接酶連接目的片段和線(xiàn)性化的空質(zhì)粒pLVSO2，4℃反應(yīng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，將轉(zhuǎn)化的菌液涂于含有氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)12 h，提取陽(yáng)性克隆進(jìn)行少量擴(kuò)增、質(zhì)粒小提，以BamHI單酶切鑒定陽(yáng)性細(xì)菌克隆和序列測(cè)序驗(yàn)證。各取3 mL已滅菌的LB（含氨芐青霉素濃度為50 μg/mL）分別加入2 μL空載體對(duì)照菌液和鑒定正確的Parkin過(guò)表達(dá)菌液，混勻，37℃，180 r/min搖菌4~6 h，然后分別取2 mL進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用200 mL已加氨芐青霉素濃度50 μg/mL高壓滅過(guò)菌的LB培養(yǎng)基混勻，37℃、210 r/min過(guò)夜搖菌培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后按照QIAGEN plasmid purification midi kit操作對(duì)Parkin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pLVSO2-Parkin）和空載體對(duì)照質(zhì)粒（pLVSO2）進(jìn)行提取。

1.2.4 293 T細(xì)胞轉(zhuǎn)染及慢病毒包裝 目的質(zhì)粒和對(duì)照提取成功后，利用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用兩包裝質(zhì)粒系統(tǒng)（psPAX2/pMD2.G）包裝質(zhì)粒，以質(zhì)粒∶psPAX2∶pMD2.G（4∶3∶1）比例混合后用Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別收集48 h和72 h的病毒液，并用過(guò)濾器（Millipore）5 000 r/min×15 min過(guò)濾收集濃縮病毒液于-80℃保存。

1.2.5Parkin過(guò)表達(dá)PC12細(xì)胞株的構(gòu)建 將PC12細(xì)胞鋪板在6孔板中，細(xì)胞密度約為50%，按質(zhì)粒病毒上清∶聚凝胺（polybrene）∶1640培養(yǎng)基（100 μL∶1 μL∶1 mL）試劑比例加入到6孔板中，接著用48孔板內(nèi)以（5~8）×104cells/孔的密度鋪板，鋪?zhàn)銐蛄康目滓赃M(jìn)行后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞孵育過(guò)夜。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%~80%融合度時(shí)，分別加入嘌呤霉素（puromycin）至終質(zhì)量濃度為2.4 μg/mL、3 μg/mL，3.6 μg/mL、4 μg/mL，處理48 h后細(xì)胞全部死亡的最低藥物濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)擬用的濃度。在6孔板中加入確定好的藥篩濃度繼續(xù)培養(yǎng)PC12細(xì)胞4 d后，用qPCR和WB方法驗(yàn)證Parkin過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.2.6 熒光定量PCR檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中ParkinmRNA表達(dá)水平Trizol法提取過(guò)表達(dá)ParkinPC12細(xì)胞系和對(duì)照質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)PC12細(xì)胞系的總RNA，用Nanodrop光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。1 μg總 量RNA采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA。SYBR Green熒光定量法檢測(cè)ParkinmRNA水平，反應(yīng)體系10 μL（SYBR premix Ex TaqII 5 μL；forward/reverse primer各0.5 mL；ddH2O 2 μL；模板cDNA 2 μL）；RT-PCR運(yùn)行條件為：95℃15 s，60℃30 s，72℃4 min 40個(gè)循環(huán)，其中Parkin正向引物序列5'-TTCCAATGTAACCACCGCCA-3'，反 向 引 物序列5'-CACTCCTCGGCACCATACTG-3'。

1.2.7 Western blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中Parkin蛋白表達(dá)水平 收集Parkin過(guò)表達(dá)細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞，使用裂解液、蛋白酶抑制劑制備蛋白樣本，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度，取適量蛋白樣品加入loading buffer混勻，100℃煮沸5 min使蛋白變性，等量上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后并轉(zhuǎn)至PVD膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，分別用Parkin多克隆抗體（1∶1 000，abcam）和兔GAPDH抗體（1∶500，abcam）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗4次，每次5 min，分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志的山羊抗兔（1∶8 000，abcam）二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，顯影讀片，應(yīng)用Image-J軟件分析條帶的灰度值。Parkin蛋白相對(duì)表達(dá)量以Parkin蛋白灰度值與GAPDH蛋白內(nèi)參灰度值比值表示，重復(fù)3次取均值。

1.2.8 過(guò)表達(dá)Parkin的PD細(xì)胞模型建立 細(xì)胞培養(yǎng)同“1.2.1”，實(shí)驗(yàn)分組為不作處理組[PC12、PC12-對(duì)照（空載體對(duì)照質(zhì)粒）、PC12-Parkin]和處理組（加30 μmol/L的6-OHDA作用時(shí)間48 h，建立PD細(xì)胞模型，后棄掉6-OHDA再繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，為PC12+6-OHDA和PC12-Parkin+6-OHDA組）。

1.2.9 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將“1.2.5”中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化下來(lái)，根據(jù)計(jì)數(shù)情況及接種量（5 000個(gè)/孔）制備細(xì)胞懸液（100 μL/孔），將制備好的細(xì)胞懸液接種到96孔板中，放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5%CO2）4 h、24 h、48 h和72 h，向每孔（100 μL）加入10 μL CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.2.10 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè) 將“1.2.5”中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化下來(lái)，PBS洗2次，棄去PBS，每管加入1 mL staining buffer，再加入1 μL JC-1（終濃度為2 μmol/L），另外陽(yáng)性對(duì)照組加入1 mL CCCP（終濃度為50 μmol/L）輕輕混勻后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS重懸，重復(fù)該離心步驟1次，棄上清加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，最后用流式檢測(cè)結(jié)果。

1.2.11 細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的檢測(cè) 將“1.2.5”中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化下來(lái)，PBS洗2次，棄去PBS，每組加入1∶1 000稀釋的探針1 mL，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）內(nèi)避光孵育30 min。吸棄探針，加入1 mL PBS清洗，1 500 r/min，5 min，25℃，棄上清（重復(fù)1次），最后加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)移至流式上樣管中，在激發(fā)波長(zhǎng)535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)610 nm附近測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.2.12 Bax和α-synuclein mRNA和蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 方法同“1.2.4”和“1.2.5”，其中Bax正向引物序列5'-GCCCTTTTGCTTCAGGGTTT-3'，反向引物序列為5'-GGAAAAAGACCTCTCGGGGG-3'；α-synuclein正向引物序列5'-GAGGGCGTCCTC‐TATGTAGGT-3'，反 向 引 物 序 列5'-CCCTCTTGT‐GGGTACCCTTCT-3'。Western blot檢測(cè)抗體情況。

1.2.13數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Parkin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒克隆及穩(wěn)轉(zhuǎn)株感染構(gòu)建和parkin蛋白表達(dá)的鑒定

成功合成Parkin編輯區(qū)序列并克隆帶有GFP熒光標(biāo)簽的過(guò)表達(dá)骨架獲得過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pLVSO2-Parkin），單酶切后，在8 000~10 000 bp之間有一條清晰且單一的條帶（圖1A），測(cè)序結(jié)果和NCBI上公布的Parkin基因序列完全一樣，片段大小為1 413 bp。將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒（pLVSO2-Parkin）以及對(duì)照空載體質(zhì)粒（pLVSO2）通過(guò)pCMV-VSV-G/pMDLg pRRE/pRSV-Rev三包裝質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，48 h后可見(jiàn)大量綠色熒光（圖1B）。包裝目的質(zhì)粒獲得病毒顆粒后，感染PC12細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后傳代培養(yǎng)獲得過(guò)表達(dá)Parkin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，熒光檢測(cè)證明99%以上細(xì)胞有熒光表達(dá)（圖1C）。收集上述細(xì)胞用蛋白裂解液提取總蛋白，Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pLVSO2-Parkin重組質(zhì)粒后，293TParkin過(guò)表達(dá)細(xì)胞中Parkin表達(dá)顯著升高（P<0.01，圖1D），PC12-Parkin過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系成功過(guò)表達(dá)PARK2蛋白，含量相對(duì)于對(duì)照組增加了約3倍（P<0.01，圖1E）。進(jìn)一步qPCR結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞比較，PC12-Parkin過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中的ParkinmRNA水平顯著提高（P<0.05，圖1F）。

圖1 Parkin過(guò)表達(dá)載體酶切鑒定及穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建和Parkin表達(dá)效果鑒定Figure 1 Identification of Parkin overexpression vector by enzyme digestion,construction of stable cell line and identification of Parkin expression effect

2.2 PD細(xì)胞模型構(gòu)建及Parkin的保護(hù)作用

6-OHDA處理PC12細(xì)胞可以構(gòu)建誘導(dǎo)損傷的PD細(xì)胞模型。在0~200 μmol/L 6-OHDA作用48 h后，與正常對(duì)照組比較，細(xì)胞存活率呈劑量依賴(lài)性下降的趨勢(shì)（見(jiàn)圖2A），6-OHDA濃度為10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為93.74%；50 μmol/L時(shí)，存活率為53.92%；100 μmol/L時(shí)，存活率為22.64%；200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為11.02%。提示用50 μmol/L濃度的6-OHDA處理細(xì)胞時(shí)，6-OHDA有明顯的細(xì)胞毒性作用。選擇50 μmol/L作為過(guò)表達(dá)Parkin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株以及PC12細(xì)胞株的PD造模劑量。

50 μmol/L濃度的6-OHDA處理Parkin過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（PC12-Parkin+6-OHDA）和PC12細(xì)胞株（PC12+6-OHDA），同時(shí)含有未用6-OHDA處理的Parkin過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（PC12-Parkin）、對(duì)照質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（PC12-對(duì)照）和PC12細(xì)胞株（PC12），分別觀(guān)察4 h、24 h、48 h和72 h各組細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，相對(duì)于其他未處理組，作用24 h后，PC12+6-OHDA組（PD模型組）和PC12-Parkin+6-OHDA組（Parkin基因過(guò)表達(dá)PD模型組）的A450水平顯著降低（P<0.05）；作用48 h和72 h后，PC12+6-OHDA組和PC12-Parkin+6-OHDA組A450水平進(jìn)一步降低（P<0.01），但相對(duì)于PC12+6-OHDA組，PC12-Parkin+6-OHDA組的A450值較高（P<0.05）。見(jiàn)圖2B。

圖2 PD細(xì)胞模型構(gòu)建及Parkin過(guò)表達(dá)保護(hù)檢測(cè)Figure 2 Construction of PD cell model and detection of Parkin overexpression protection

2.3 Parkin過(guò)表達(dá)對(duì)PD模型線(xiàn)粒體膜電位的影響

在沒(méi)有6-OHDA處理?xiàng)l件下，PC12組、PC12空載對(duì)照組以及PC12-Parkin過(guò)表達(dá)組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位水平無(wú)明顯差異。當(dāng)用6-OHDA處理刺激下，PC12組和PC12-Parkin過(guò)表達(dá)組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位水平均顯著降低（P<0.05），但PC12-Parkin過(guò)表達(dá)組細(xì)胞下降幅度明顯減弱。見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位Figure 3 Detection of the mitochondrial membrane potential of cells by flow cytometry

2.4 Parkin過(guò)表達(dá)對(duì)PD模型細(xì)胞ROS水平的影響

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，相對(duì)于PC12組、PC12-空載對(duì)照組和PC12-Parkin過(guò)表達(dá)組，PC12+6-OHDA組和PC12-Parkin+6-OHDA組細(xì)胞ROS含量顯著增加（P<0.01，P<0.05），PC12+6-OHDA組比PC12-Parkin+6-OHDA組增加明顯，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平Figure 4 Detection of intracellular ROS levels of cells by flow cytometry

2.5 Parkin過(guò)表達(dá)對(duì)PD模型細(xì)胞中關(guān)鍵指標(biāo)Bax和α-synuclein表達(dá)的影響

PD模型中促凋亡相關(guān)蛋白（Bax）和α-synuclein是關(guān)鍵指標(biāo)蛋白。采用熒光定量PCR和Western blot評(píng)估各組的Bax和α-synuclein的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，與PC12+6-OHDA組比較，PC12-Parkin+6-OHDA組的Bax和α-synu‐clein的表達(dá)均顯著下降（P<0.01），說(shuō)明Parkin具有保護(hù)作用；PC12+6-OHDA組與其他3組（未加藥組）比較，PC12+6-OHDA組的Bax表達(dá)顯著上升（P<0.01），表明模型制備成功。PC12-Parkin過(guò)表達(dá)組相比于PC12-對(duì)照組的Bax和α-synuclein的表達(dá)也有下調(diào)（P<0.01），表明Parkin在未誘導(dǎo)損傷情況下也具有降低Bax和α-synuclein表達(dá)的作用，從而對(duì)細(xì)胞抗損傷起保護(hù)作用。

圖5 Bax、α-synuclein指標(biāo)檢測(cè)Figure 5 Detection of the expression of Bax and α-synuclein

3 討論

目前，人們對(duì)帕金森病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全研究清楚，其中遺傳和環(huán)境因素被認(rèn)為是造成帕金森病患者多巴胺能神經(jīng)元損傷的主要原因。本研究通過(guò)使用6-OHDA處理PC12細(xì)胞作為體外PD模型，研究過(guò)表達(dá)Parkin蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)α-synu‐clein在PD發(fā)病機(jī)制中的作用。PC12細(xì)胞是目前用來(lái)研究PD發(fā)病機(jī)制最多的細(xì)胞株，其高分化能表達(dá)絡(luò)氨酸羥化酶并且能合成多巴胺，在形態(tài)、生理和生化等方面都非常接近中腦邊緣（SN）的多巴胺神經(jīng)元（DA），所以被廣泛用于建立PD體外模型的研究[6]。6-OHDA為兒茶酚胺的羥基化衍生物，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)會(huì)被氧化成具有神經(jīng)毒性的羥自由基和醌類(lèi)物質(zhì)，是一種有效導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元變性的神經(jīng)毒劑，是體外PD建模最常用的一種藥物[7]。葉錫勇等[8]探討6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的可能作用機(jī)制研究中，結(jié)果表明6-OHDA能夠?qū)е翽C12細(xì)胞凋亡，在一定范圍內(nèi)隨著濃度增高細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。李艷霞等[9]探討6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞的凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響中，采用60 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞24 h致接近細(xì)胞半致死率，成功建立PC12帕金森細(xì)胞模型，結(jié)果表明模型細(xì)胞的凋亡率較正常對(duì)照組細(xì)胞明顯增高。在本研究中，用0~200 μmol/L 6-OHDA作用48 h細(xì)胞存活率呈劑量依賴(lài)性下降的趨勢(shì)，當(dāng)6-OHDA濃度為50 μmol/L時(shí)，PC12細(xì)胞存活率為53.92%，說(shuō)明該劑量濃度有明顯的毒性效應(yīng)，同時(shí)也表明了在本實(shí)驗(yàn)中50 μmol/L 6-OHDA是成功建立PC12帕金森細(xì)胞模型的最佳濃度。

近幾年來(lái)，人們對(duì)帕金森病相關(guān)基因的研究越來(lái)越多，給研究者帕金森病的發(fā)病機(jī)理提供了新的思路。在這些基因中，由PARK2基因編碼的Parkin蛋白被認(rèn)為與隱形遺傳的帕金森病聯(lián)系最為緊密[10]。Parkin屬于E3泛素化連接酶，能特異性把底物打上泛素化標(biāo)簽，通過(guò)泛素化蛋白酶體系對(duì)底物起到降解作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，Parkin能夠保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元抵抗神經(jīng)毒素所造成的損傷[11]。在本研究中，成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)Parkin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，為了驗(yàn)證Parkin蛋白在帕金森病中的重要作用，采用50 μmol/L濃度的6-OHDA處理過(guò)表達(dá)Parkin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和PC12細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Parkin能夠抑制6-OHDA引起的細(xì)胞凋亡，與Houbo等[11]在Parkin對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究中的結(jié)果一致；在祁雪等[12對(duì)Parkin與線(xiàn)粒體穩(wěn)定相關(guān)的帕金森病機(jī)制研究中，選擇沉默PC12細(xì)胞內(nèi)的Parkin蛋白，并與正常細(xì)胞內(nèi)加等量MPP+比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者PC12細(xì)胞存活率降低更為明顯。

近年的研究表明Parkin蛋白在維持線(xiàn)粒體的質(zhì)量方面也發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立Parkin過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型以及Parkin-PD細(xì)胞模型，進(jìn)一步從Parkin基因的角度了解其對(duì)PD細(xì)胞線(xiàn)粒體功能的影響。本研究中，過(guò)表達(dá)Parkin對(duì)線(xiàn)粒體膜電位并無(wú)明顯影響，值得注意的是6-OHDA會(huì)引起細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降，但是Parkin-PD模型組線(xiàn)粒體膜電位較PD模型組略高，說(shuō)明Parkin蛋白在一定程度上維持了6-OHDA引起細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降的作用。細(xì)胞氧化應(yīng)激水平變化檢測(cè)結(jié)果表明，PC12細(xì)胞在6-OHDA的刺激下線(xiàn)粒體的ROS水平顯著升高，與焦玲等[13]研究α硫辛酸抑制6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中α-synuclein表達(dá)及機(jī)制中對(duì)線(xiàn)粒體的ROS水平檢測(cè)結(jié)果一致；Lee等[14]用6-OHDA處理PC12細(xì)胞后也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著升高。本研究表明Parkin-PD模型組ROS水平顯著高于未處理PC12細(xì)胞組，但與PC12-PD模型組相比，ROS水平有顯著降低的趨勢(shì)。Ashrafi等[15]發(fā)現(xiàn)Parkin突變患者體內(nèi)有大量線(xiàn)粒體形態(tài)以及功能異常，包括ATP生產(chǎn)減少、膜電位降低、活性氧水平升高以及自噬功能改變等。其實(shí)Paikin在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，當(dāng)線(xiàn)粒體的膜電位改變時(shí)，會(huì)由胞漿轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體內(nèi)，在線(xiàn)粒體中表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞色素產(chǎn)生使異常的線(xiàn)粒體自噬，從而維持線(xiàn)粒體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，以減輕膜電位減低、ROS升高對(duì)細(xì)胞造成損傷。

目前已知α-synuclein是導(dǎo)致PD發(fā)生的重要因素[16-18]，它是一種腦內(nèi)廣泛表達(dá)的神經(jīng)蛋白，在機(jī)體發(fā)生的生理過(guò)程和多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用[19]。研究報(bào)道，α-synuclein的積累會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡，甚至?xí)劳觯瑫?huì)出現(xiàn)典型的PD癥狀[20]，如何清除α-synuclein的聚集成為了研究PD發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。當(dāng)前研究最多的是通過(guò)泛素蛋白酶體途徑對(duì)α-synuclein起到降解作用，在泛素蛋白酶體途徑中涉及到一種關(guān)鍵蛋白——Parkin蛋白。Parkin蛋白主要是通過(guò)一種E1激活酶和E2結(jié)合酶共同激活一種或幾種需要降解的蛋白質(zhì)，促進(jìn)其泛素化[21]。本研究中，6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型α-synuclein表達(dá)顯著升高，同時(shí)在PC12-Parkin+6-OHDA組中，α-synuclein表達(dá)較PC12+6-OHDA組顯著降低，表明α-synuclein是Parkin蛋白酶的作用底物，通過(guò)泛素蛋白酶體途徑對(duì)其泛素化降解并清除，發(fā)揮抗6-OHDA誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。細(xì)胞凋亡是一種自主性程序性死亡，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程及維持體內(nèi)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起到重要作用，研究報(bào)道AD、PD及ALS等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中往往伴隨著神經(jīng)元的凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，6-OHDA處理后，PC12細(xì)胞組的Bax表達(dá)量明顯升高，Parkin過(guò)表達(dá)PC12細(xì)胞組比PC12-6-OH‐DA組表達(dá)量有顯著下降的趨勢(shì)，因此推測(cè)Parkin蛋白在抗6-OHDA毒性作用機(jī)制可能與抑制線(xiàn)粒體凋亡通路和降低α-synuclein蛋白表達(dá)相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，通過(guò)Parkin表達(dá)降低了6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性，起到了保護(hù)神經(jīng)元的作用，這種作用可能是通過(guò)提高蛋白酶體的活性，促進(jìn)α-synuclein的降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本結(jié)果為進(jìn)一步研究6-OHDA在神經(jīng)系統(tǒng)損傷的作用機(jī)制提供依據(jù)，也為帕金森病的治療提供新的理論依據(jù)。