Bazedoxifene治療SLE小鼠的療效及對CD4+T細胞亞群的影響

張瑩，代春燕,田吉來

(1.南京中醫藥大學中西醫結合鼓樓臨床醫學院風濕免疫科,江蘇 南京 210008;2.夏津縣人民醫院血液透析科,山東 德州 253200;3.南京中醫藥大學醫學院,整合醫學學院生物化學與分子生物學系,江蘇 南京 210023)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種主要累及女性尤其是育齡期女性的自身免疫性疾病，以自身抗體產生、免疫復合物沉積和慢性炎癥引發細胞因子激活和組織損傷為特征。白細胞介素-6(IL-6)是調節免疫和炎癥的重要細胞因子，調控輔助T細胞(Th)1/Th2、Th17/Treg平衡，參與濾泡輔助T細胞(Tfh)輔助B細胞活化成熟[1]；IL-6和IL-6受體表達異常，與SLE疾病活動相關，是治療SLE的潛在靶點[2-4]。同時，雌激素-雌激素受體(ER)-α和ER-β在誘發和加重SLE方面發揮一定的作用。雌激素通過ER-α參與T細胞和B細胞活化、炎癥和自身抗體產生[5]。

巴多昔芬(bazedoxifene,BAZ,結構式見圖1)是一種新型的第三代選擇性雌激素受體調節劑(SERMs)，在不同的靶組織表現出雌激素的激動或拮抗作用。例如，BAZ能促進ER-α在子宮和乳房部位的降解，發揮抗雌激素作用；同時對骨骼系統的ER-β起到活化作用，從而增加脊椎與髖部的骨密度[6]。2013年BAZ被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準用于絕經后骨質疏松癥的預防和治療。2014年，Li等[7]利用計算機多配體同時對接技術發現BAZ的吲哚部分和七元氮雜環擬似IL-6的Trp157和Leu57基團，從而可與其受體gp130 D1區域進行有效結合，發揮拮抗IL-6的作用。在隨后的細胞與動物實驗中證實BAZ可通過抑制IL-6/gp130實現治療胰腺癌[8]、橫紋肌肉瘤[9]、結腸癌[10]、三陰性乳腺癌[11]的目的。

圖1 巴多昔芬的化學結構式

BAZ作用于ERs和gp130，具有治療SLE的可能性，本文擬利用MRL/lpr狼瘡小鼠，評估BAZ對SLE小鼠的治療作用及對脾臟CD4+T細胞亞群的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 MRL/lpr小鼠(雌性，18周)購自中國上海SLAC實驗室動物有限公司，并在南京鼓樓醫院實驗動物中心的無特定病原體(specific-pathogen-free,SPF)條件下飼養。所有動物實驗均在南京鼓樓醫院動物研究倫理委員會批準的規程下進行。醋酸巴多昔芬購于江蘇正濟藥業股份有限公司。泊洛沙姆188(Kolliphor P188)購于巴斯夫(中國)有限公司。

1.2 藥物配制 稱取醋酸巴多昔芬和泊洛沙姆188分別為4 mg和3 mg，溶解在1 mL去離子水中，4 ℃下儲存備用。

1.3 給藥與動物實驗 實驗組給予18周齡MRL/lpr小鼠(n=6)醋酸巴多昔酚20 mg·(kg·d)-1灌胃，對照組給予等濃度的泊洛沙姆188灌胃，均連續給藥4周。末次給藥后代謝籠收集小鼠24 h尿液，考馬斯亮藍法檢測尿蛋白含量。小鼠摘眼球取血，分離血漿，用鼠抗dsDNA ELISA試劑盒(Shibayagi,日本)對血漿中dsDNA抗體水平進行測定。麻醉處死小鼠，75%乙醇消毒腹部皮膚，切開腹腔，取出脾臟和腎臟，稱取濕重并記錄。根據下列公式計算小鼠脾臟指數。

脾臟指數=脾臟濕重(g)/小鼠體重(g)

1.4 分離小鼠脾臟淋巴細胞 脾臟稱重后充分研磨，然后于200目篩網過濾制成單細胞懸浮液，1 300 r·min-1離心5 min，棄上清，加入10倍體積的紅細胞裂解液，室溫裂解3 min，再用PBS充分洗滌次后重懸計數，將脾細胞以5×106mL-1的密度懸浮在含100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素，2 mmol·L-1谷氨酰胺和10%胎牛血清(GIBCO)RPMI 1640完全培養基中。

1.5 流式細胞檢測脾臟CD4+T細胞亞群 為了鑒定Treg，取1×106個脾細胞加入FITC-anti-CD4室溫避光孵育15 min，對照管加入同型對照，PBS洗滌兩次后加入固定破膜劑200 μL，然后在4 ℃破膜1 h后，PBS洗一遍，加入anti-Foxp3-PE 4 ℃孵育30 min，PBS洗滌兩次后上機檢測，每個樣本收集10 000個陽性細胞。對于Th1/Th2/Th17細胞亞群分析，取2×106個細胞種植于96孔板/孔，50 ng·mL-1phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)、1 μg·mL-1離子霉素和5 μg·mL-1布雷非德菌素A(BFA)刺激4 h。然后，FITC-anti-CD4室溫避光孵育15 min；對照管加入同型對照，操作步驟同檢測管，PBS洗滌兩次后加入固定破膜劑200 μL，然后在4 ℃破膜1 h后，PBS洗一遍，加入APC-anti-IFN-γ(Th1)，PE-anti-IL4和(Th2)以及APC-anti-IL17A(Th17)4 ℃孵育30 min進行標記， PBS洗滌兩次后上機檢測，每個樣本收集10 000個陽性細胞。所有抗體、流式試劑均購eBioscience(San Diego,CA,USA)。通過流式細胞儀(Calibur，BD Biosciences,CA,USA)獲取數據，并使用FlowJo軟件(Tree Star,USA)進行分析。

1.6 腎臟的病理評估 處死小鼠后，切開腹腔，去除包膜，取出腎臟，沿冠狀切面平均分開，浸泡于冰PBS。4%低聚甲醛固定12 h以上，脫水，然后石蠟包埋，切成4 μm薄片。每只小鼠選取2張切片進行蘇木精和曙紅(H&E)染色。每張切片隨機選取3個200倍視野，按照Chan報道的評分方案[12]，對每個隔室(腎小球、間質)使用 0-4+量表，將病理分級為不存在、輕度、中度或重度的半定量方法對腎炎和血管炎的嚴重程度進行分級和損傷指數評分。

2 結果

2.1 BAZ有效緩解MRL/lpr小鼠狼瘡表型 與輔料對照組(vehicle,VEH)相比，BAZ治療組并沒有顯著降低小鼠的體重(P=0.1243，見圖2A)，但MRL/lpr小鼠脾臟指數顯著降低(脾重/體重,g·g-1)(P<0.05,見圖2B)?？闺p鏈 DNA(dsDNA)抗體是SLE的致病性抗體，但BAZ治療組抗dsDNA抗體的含量與對照組無顯著差別(P>0.05,見圖2C)。腎臟是SLE最易累及的重要臟器，腎臟損傷后臨床出現蛋白尿。與對照組相比，BAZ治療顯著降低SLE小鼠蛋白尿(P<0.01,見圖2D)。

A.MRL/lpr小鼠的體重；B.MRL/lpr小鼠脾臟指數；C.血清抗dsDNA抗體含量； D.24 h尿蛋白圖2 BAZ 顯著緩解MRL/lpr小鼠的狼瘡表型注：BAZ n=6,VEH(輔料組) n=6，*P<0.05，**P<0.01

2.2 BAZ減輕MRL/lpr小鼠腎臟損傷 我們進一步分析BAZ治療對狼瘡小鼠腎臟損傷的影響。腎臟病理發現，對照組腎小球系膜細胞、內皮細胞、系膜基質出現彌漫性增生，腎間質可見彌漫性炎癥細胞的浸潤，基本符合狼瘡腎炎的病理表現。而BAZ治療可顯著減低腎小球增殖(P<0.05,見圖3A、B)，減輕腎小管間質炎癥細胞浸潤(P<0.05,見圖3A、C)。

2.3 BAZ調節MRL/lpr小鼠Th2/Treg平衡 CD4+T細胞亞群在SLE發病中發揮重要作用，Th1和Th17分泌炎癥因子，參與SLE重要臟器炎癥，Th2輔助漿細胞分化成熟參與自身抗體產生。本研究進一步探討BAZ治療對狼瘡小鼠脾臟CD4+T細胞亞群的影響。結果如圖4所示，BAZ顯著降低SLE小鼠脾臟Th2細胞比例(見圖4 C、D)，提高Treg比例(見圖4 G、H)，對Th1和Th17亞群沒有顯著影響(見圖4A、B、E、F)。

A.BAZ治療組和對照組狼瘡小鼠腎小球增生病變和腎小管間質炎癥細胞浸潤；B.腎小球病理損傷指數；C.腎小管間質損傷指數圖3 BAZ減輕MRL/lpr小鼠腎臟損傷 注：*P<0.05，BAZ n=6,VEH n=6

A.Th1細胞;B.Th1占CD4+T細胞比例；C.Th2細胞；D.Th2占CD4+T細胞比例；E.Th17細胞；F.Th17占CD4+T細胞比例；G.Treg細胞；H.Treg占CD4+T細胞比例圖4 流式細胞術分析BAZ治療組(圖A、C、E、G右列)和對照組(圖A、C、E、G左列)小鼠脾臟CD4+T細胞亞群 注：BAZ(n=6),VEH(n=6),*P<0.05，**P<0.01

3 討論

本研究發現，BAZ治療組MRL/lpr小鼠脾重指數顯著減小，有效減弱因Fas基因突變致淋巴細胞增生而出現的脾臟代償性肥大，說明BAZ具有改善小鼠淋巴細胞功能紊亂，調整免疫功能的潛能。BAZ治療后，小鼠蛋白尿顯著較少，且能顯著緩解腎小球增生性病變，減輕腎小管間質炎癥細胞浸潤，提示BAZ可以降低MRL/lpr小鼠重要臟器的炎癥損傷。

BAZ的治療作用可能與IL-6/gp130信號通路相關。IL-6可通過經典信號(classic-signaling)或轉移信號(trans-signaling)分別與膜結合型 IL-6 受體(mIL-6R) 或可溶型IL-6 受體(sIL-6R)結合，均可觸發gp130 的二聚化，激活 JAK/STAT 信號通路從而表現出致病作用[12]。有報道SLE小鼠的血清 IL-6 升高及存在 IL-6R 的異常表達[13-15]。在其他小鼠品系中，外源性 IL-6 促進自身抗體的產生，并加速腎小球腎炎的進展[16]；阻斷 IL-6 或其受體可防止雄性小鼠的抗dsDNA抗體升高，減少蛋白尿并降低死亡率[17]。此外，SLE 患者血清 IL-6 水平升高[2-4,18-19]，與疾病活動和抗 dsDNA 水平相關[3,18]。在體外，阻斷 IL-6 可抑制免疫球蛋白和抗 dsDNA抗體的產生，提高巨噬細胞通過自噬途徑降解[20]。SLE患者阻斷 IL-6Rs 會降低體內B細胞和T細胞的活化[21]。評價IL-6單克隆抗體Sirukumab和IL-6R單克隆抗體托株單抗治療SLE的多中心臨床試驗正在進行[22]。以上說明抑制IL-6/IL-6R成為治療SLE的一項有效策略。

IL-6可調節Th1/Th2平衡，通過促進IL-4的自分泌，促進Th2分化[23]。本實驗發現BAZ顯著降低SLE小鼠脾臟Th2細胞的比例，可能與BAZ抑制了IL-6/gp130有關。IL-6可調節Treg/Th17平衡[24]。目前認為，Th17是自身免疫病發的關鍵角色，而Treg可抑制異?；罨男猅細胞反應。IL-6聯合TGF-β可誘導初始T細胞向Th17分化； 相反，IL-6可抑制TGF-β誘導的Treg分化。本實驗發現BAZ顯著提高Treg的比例，說明了BAZ拮抗IL-6作用的可能性。盡管有報道IL-6可通過聚類信號模式(cluster-signaling)激活初始T細胞gp130，使之分化為致病性的Th17 細胞[25]，本實驗沒有發現BAZ對脾臟Th17的顯著影響。同樣，Anderson等報道BAZ治療膠原誘導小鼠關節炎不影響Th17細胞的比例[26]。

BAZ的治療作用還不能避免與調節ERs相關。SLE具有顯著的性別趨向性，女性多見，尤其是育齡期女性。雌激素作用于ER-α 和ER-β，分別發揮促炎和抗炎的作用。SLE 患者組外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中ER-α mRNA 的表達顯著高于正常對照組，SLE病情活動組PBMC ER-α mRNA表達水平顯著高于病情緩解期組[27]。研究者Inui A 觀察到比健康對照相比，SLE疾病活動指數(SLEDAI)-2K評分≥6的SLE患者外周血T細胞ER-β的表達量顯著降低；SLE患者PBMC ER-β-mRNA的表達水平與SLEDAI 評分呈負相關[28]。雌激素驅動Th1細胞應答依賴于ER-α介導的信號傳導，在ER-α缺陷小鼠淋巴結中分泌IFN-γ的細胞減少[29]。同時ER-α通過與GATA3、Foxp3相互作用，可增加小鼠和人Th2、Treg的分化[30]。BAZ治療后顯著提高SLE小鼠脾臟Treg比例，減小Th2比例，可能和ER-α通路有關。

本研究初步證實BAZ治療小鼠SLE有效，可減少SLE小鼠脾重、蛋白尿，減輕腎臟損害，調節SLE小鼠脾臟CD4+T細胞亞群。BAZ可能調控IL-6信號通路、ERs信號通路及作用機制有待更深入研究。