高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法測(cè)定液態(tài)乳中乳果糖含量

孫 佩，任 碩，陳柔含，古淑青*，鈕 冰，鄧曉軍

（1.上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 食品工程系，上海 200436；2.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135；3.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708）

乳果糖，又名4-Ο-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖，是液態(tài)乳熱加工過(guò)程中，乳糖在酪蛋白游離氨基的催化下堿基異構(gòu)化形成的一種雙糖［1］。乳果糖在生牛乳中含量甚微，不同的加熱處理方式產(chǎn)生的乳果糖含量不同。因此，乳果糖可作為判斷液態(tài)奶熱加工方式的重要指標(biāo)［2］。國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)（IDF）建議乳果糖作為區(qū)分巴氏殺菌乳、超高溫瞬時(shí)滅菌乳（UHT milk）的指標(biāo)，并規(guī)定其在UHT乳中的含量為100～600mg/L［3－4］。

目前乳果糖測(cè)定方法以酶催化法［5］、酶解－分光光度法［6－7］、離子色譜法［8－9］、氣相色譜法［10－11］和液相色譜法［4，7，12?13］為主。我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布的NY/T939－2016標(biāo)準(zhǔn)采用多步酶解反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)乳果糖［6］，但該方法需用6種酶，任何一種酶失活都將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，且操作繁瑣耗時(shí)［7］。在離子交換色譜中，乳果糖和色譜柱離子成分之間通過(guò)進(jìn)行離子交換而保留，因此控制目標(biāo)樣品在堿性/酸性溶液中呈現(xiàn)離子化狀態(tài)是關(guān)鍵［14］。但糖類(lèi)物質(zhì)在電極表面易與某些分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而影響方法的準(zhǔn)確性［15］。氣相色譜法靈敏度高，卻難以實(shí)現(xiàn)乳果糖與液態(tài)乳中其他二糖的分離［16］。Liu等［17］建立了液態(tài)乳中乳果糖的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，該方法靈敏度高，但質(zhì)譜儀器昂貴，成本較高，且需先進(jìn)行酶解以排除麥芽糖的干擾。

高效液相色譜法能同時(shí)檢測(cè)多種糖分，具有檢測(cè)效率高、靈敏度好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，其檢測(cè)器主要有示差折光檢測(cè)器（RID）和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）［18］兩種。相對(duì)于RID，ELSD更穩(wěn)定，且分離糖類(lèi)化合物效果好［19］。Schmidt等［20］開(kāi)發(fā)了一種定量復(fù)雜糖溶液中乳果糖的HPLC?ELSD，能排除結(jié)構(gòu)相似或分子量相同的糖類(lèi)干擾，但該方法只適用于酶法生產(chǎn)的乳果糖樣品。李盛楠等［21］使用改性酰胺柱對(duì)滅菌乳中的乳果糖進(jìn)行分離，但為避免乳中其他二糖與酰胺柱上的活性基團(tuán)結(jié)合對(duì)色譜峰產(chǎn)生干擾，需在前處理過(guò)程中加入酶解步驟，增加了前處理過(guò)程的復(fù)雜度。Schuster－Wolff－Bühring等［19］發(fā)現(xiàn)氨基柱能更好地分離乳果糖、乳糖，但目前所報(bào)道的基于氨基色譜柱的乳果糖檢測(cè)均需要較長(zhǎng)時(shí)間的梯度洗脫［18－20］。因此，雖然目前已有文獻(xiàn)報(bào)道乳果糖的HPLC－ELSD測(cè)定方法，但均存在基質(zhì)不適用，前處理復(fù)雜或檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等不同程度的問(wèn)題。基于此，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上建立了液態(tài)乳中乳果糖含量測(cè)定的HPLC－ELSD，并優(yōu)化了樣品前處理?xiàng)l件及儀器參數(shù)。該方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可滿足液態(tài)乳中乳果糖含量的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

乙腈、冰醋酸（色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；醋酸銨（美國(guó)Sigma公司）；乳果糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

進(jìn)口液態(tài)乳樣品為法定入境檢驗(yàn)檢疫樣品，國(guó)產(chǎn)液態(tài)乳樣品包括無(wú)乳糖舒化奶購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

1260InfinityⅡ液相色譜（Agilent公司，USA），配蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）；Allegra X－22R離心機(jī)（Beckman Coulter公司，美國(guó)）；高速渦旋震蕩器（Eyela公司，日本）；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國(guó)）制得。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解定容至10mL，配成10mg/mL的乳果糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取乳果糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL至10mL容量瓶中，用85%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水溶液定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

為考察乳糖與乳果糖的分離效果，配制乳果糖含量為10mg/mL，乳糖含量為120mg/mL的乳果糖－乳糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用85%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈水溶液稀釋至所需濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品前處理 取1mL液態(tài)乳，加入1mL0.4 mol/L醋酸銨溶液（pH3.8 ），用水定容至5mL，渦旋混勻3min，以4000r/min離心5min。上清液經(jīng)0.22 μm水相膜過(guò)濾后，取100μL濾液用85%乙腈水定容至1mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，供色譜分析。

1.4.2 色譜條件色譜柱：氨基柱（Exsil100HAAX，150mm×2mm，3μm，Extreme公司，美國(guó)）；流動(dòng)相：乙腈－水（85∶15，體積比），流速0.8 mL/min；洗脫時(shí)間8min；柱溫箱溫度35℃；進(jìn)樣體積10μL。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件：霧化氣溫度60℃，蒸發(fā)氣溫度70℃，載氣流速1.4 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的確定

液態(tài)奶中含有大量蛋白和脂肪，未經(jīng)前處理直接進(jìn)樣會(huì)堵塞儀器管路和色譜柱，常用的蛋白質(zhì)沉淀方法有機(jī)溶劑沉淀法和pH值調(diào)節(jié)法［13］。本實(shí)驗(yàn)分別考察了95%乙醇、95%乙腈和0.4 mol/L醋酸銨（pH3.8）沉淀蛋白的效果。結(jié)果顯示：采用95%乙醇、95%乙腈沉淀蛋白后的樣品仍存在大量干擾組分（圖1A、B），無(wú)法在氨基柱上實(shí)現(xiàn)乳果糖與乳糖的分離檢測(cè)，而經(jīng)0.4 mol/L醋酸銨溶液（pH3.8 ）處理后的樣品溶液，不僅蛋白質(zhì)充分沉淀，干擾峰得以去除，乳果糖和乳糖也得以較好地分離（見(jiàn)圖1C）。

圖1 不同蛋白沉淀方法的色譜圖Fig.1 Chromatograms of different protein precipitation methods

2.2 ELSD條件的優(yōu)化

一般情況下，載氣流速越小，形成的顆粒半徑越大，對(duì)激光的散射能力也就越強(qiáng)，相應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)越大。但流速過(guò)小會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相不能被完全揮發(fā)，背景噪音增加，信噪比下降［22］。最優(yōu)的載氣流速應(yīng)在可接受噪音的基礎(chǔ)上產(chǎn)生最大響應(yīng)值。因此實(shí)驗(yàn)在霧化氣溫度70℃，蒸發(fā)氣溫度60℃條件下，考察了不同載氣流速（1.2 、1.4 、1.6 、1.8 mL/min）對(duì)信號(hào)響應(yīng)的影響（圖2A）。結(jié)果顯示：隨著載氣流速增大，待測(cè)物的峰面積逐漸減小，但信噪比呈先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)載氣流速為1.4 mL/min時(shí)達(dá)到最優(yōu)。實(shí)驗(yàn)選擇1.4 mL/min為最佳載氣流速。

圖2 不同載氣流速（A）、霧化氣溫度（B）和蒸發(fā)氣溫度（C）時(shí)乳果糖的色譜圖Fig.2 Chromatograms of ractulose under different gas flow rates（A），nebulous temperatures（B）and evaporative temperatures（C）

霧化氣溫度、蒸發(fā)氣溫度也是影響檢測(cè)靈敏度的重要因素。霧化氣溫度越高，待測(cè)組分霧化越充分，響應(yīng)值越高，但霧化氣溫度過(guò)高會(huì)使待測(cè)組分過(guò)度分散而導(dǎo)致響應(yīng)變低。蒸發(fā)氣溫度越高，溶劑揮發(fā)越充分，樣品顆粒經(jīng)散射后噪聲降低，響應(yīng)值越高，但蒸發(fā)氣溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致待測(cè)組分分解而響應(yīng)降低。因此，固定載氣流速不變，分別考察了霧化器溫度、蒸發(fā)氣溫度對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，霧化氣溫度為70℃，蒸發(fā)氣溫度為60℃時(shí)，乳果糖的響應(yīng)最高（圖2B、C）。

2.3 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

按“1.3 ”方法配制質(zhì)量濃度分別1.0 、2.0 、5.0 、10、20、50、100mg/L的乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化條件下，以乳果糖質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：乳果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0 ～100mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=1.299 x+0.1176 ，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.9980 。

以無(wú)乳糖舒化奶為空白基質(zhì)，通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)確定方法的檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10），該方法LOD為15mg/L，LOQ為50mg/L。

2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在優(yōu)化條件下，分別考察了乳果糖在巴氏滅菌乳以及超高溫滅菌乳中的回收率。采用質(zhì)譜法［17］測(cè)得巴氏殺菌乳中乳果糖的本底平均值為4.6 mg/L，超高溫滅菌乳中乳果糖的本底平均值為383mg/L；根據(jù)不同基質(zhì)中乳果糖的本底含量差異，設(shè)置巴氏滅菌乳中3個(gè)加標(biāo)水平分別為50、100、500mg/L，超高溫滅菌乳中3個(gè)水平分別為200、400、800mg/L，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，得乳果糖在巴氏滅菌乳以及超高溫滅菌乳中的回收率為85.1%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不高于7.5 %（表1）。

表1 乳果糖的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table1 Spike recoveries and RSDs of lactulose（n=6）

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法檢測(cè)20個(gè)國(guó)內(nèi)外超高溫瞬時(shí)滅菌乳中的乳果糖含量。結(jié)果顯示：超高溫瞬時(shí)滅菌乳的乳果糖含量為350～751mg/L（表2），不同樣本間乳果糖含量差異較大。根據(jù)國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T939－2016規(guī)定（超高溫瞬時(shí)滅菌乳中乳果糖含量不應(yīng)超過(guò)600mg/L），大部分市售超高溫瞬時(shí)滅菌乳均在限定范圍內(nèi)，僅1個(gè)樣品超出規(guī)定范圍，表明存在液態(tài)奶循環(huán)處理或熱處理過(guò)程中溫度過(guò)高的可能，典型樣品的乳果糖色譜圖見(jiàn)圖3。

表2 實(shí)際樣品中乳果糖的測(cè)定結(jié)果Table2 Determination result of lactulose in real samples

3 結(jié) 論

液態(tài)乳中的乳糖含量遠(yuǎn)高于乳果糖，普通方法難以將二者分離，增加了乳果糖定量的難度。本研究采用醋酸銨沉降蛋白，氨基柱分離，建立了HPLC－ELSD測(cè)定液態(tài)乳中乳果糖含量的分析方法。方法前處理快速簡(jiǎn)便，色譜柱適用性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，在優(yōu)化條件下，該方法可長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持良好的分離效果和較高的靈敏度。整個(gè)液相檢測(cè)僅需8min，與現(xiàn)有方法約需30min相比，檢測(cè)效率大大提高，可用作液態(tài)乳中乳果糖的日常檢測(cè)。