高效液相親水作用色譜－串聯質譜法同時測定人尿液中煙堿及其9種代謝物

丁 麗，趙繼俊，陳志浩，蔣錦鋒，葉長文，陳 宸，賀 琛，趙 閣

（中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001）

煙堿（Nicotine，NIC）是煙草中的主要生物堿，約占煙草生物堿總量的90%以上。卷煙抽吸時，約有40%的煙堿直接轉移至卷煙的主流煙氣和側流煙氣中［1］。人類吸入煙氣后，煙堿主要代謝為可替寧（COT）以及少量的煙堿氮氧化物（NNO）、降煙堿（NNIC）和煙堿糖苷（NIC－G）。COT進一步代謝為反-3′-羥基可替寧（OHCOT）、可替寧氮氧化物（CNO）、可替寧糖苷（COT－G）和降可替寧（NCOT）。OHCOT可進一步代謝為反-3′-羥基可替寧糖苷（OHCOT－G）。此外，人尿液中還有其他煙堿代謝物，但僅占煙堿代謝物總量的10%以下［2］。因此，同時測定人尿液中煙堿及其代謝物能有效評估煙堿的暴露情況［3］。

光度法［4－6］、免疫法［7－8］和色譜法［9－16］已被應用于人體體液中煙堿及其代謝物的測定。其中，氣相色譜－質譜法和液相色譜－質譜法由于其優越的靈敏度和選擇性而被廣泛應用于人體體液中煙堿及其代謝物的測定。NIC和COT主要采用氣相色譜－質譜法［9－12］直接檢測，OHCOT需經衍生化后由氣相色譜－質譜法檢測，糖苷類（COT－G和OHCOT－G）主要通過氣相色譜－質譜間接測定由β-葡萄糖苷酶水解后的苷元得到其含量［9，11］。液相色譜－質譜法更便捷，可直接用于煙堿代謝物，包括糖苷類代謝物的測定［13－18］。本課題組曾報道了一種液相色譜－質譜法檢測尿液中煙堿及其9種代謝物的方法［13］，尿液用水稀釋后直接進樣，然而由于COT－G在反相柱中保留較弱，出峰較早（保留時間為1.96 min），基質效應影響大，導致尿液樣品中該峰的峰形差。因此，本文嘗試用親水作用色譜分離煙堿及其代謝物以改善COT－G的分離度，提高質譜檢測的靈敏度。親水作用色譜－串聯質譜已應用于吸食無煙氣煙草制品的冰球運動員尿液中NIC、COT和OHCOT的同時檢測［19］，顯示出較好的分離度、峰形以及較高的靈敏度，但該方法前處理較繁瑣。

本研究建立了一種同時檢測煙堿及上述9種代謝物的溶劑直接稀釋結合高效液相親水作用色譜－串聯質譜方法，目前尚無相關報道。該方法的前處理簡單，且親水作用色譜改善了COT－G的分離效果，高有機相比例的流動相提高了質譜檢測靈敏度。該方法適用于大批量樣品的檢測，為評價人類卷煙煙氣暴露量提供了一種快速、靈敏的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；API4000液相色譜－質譜聯用儀（美國應用生物系統公司）；Atlantis HILIC Silica色譜柱（3.0 mm×100mm，3.0 μm，美國安捷倫公司）；Milli－Q50超純水儀（美國Millipore公司）；CP2245分析天平（感量0.0001 g，德國Sartorius公司）；0.22 μm有機濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司）。

超純水（電導率≥18.2 MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色譜純，迪馬公司）；甲酸銨（色譜純，安譜公司）；NIC、NIC－G、COT、COT－G、OHCOT、OHCOT－G、NNIC、NCOT、CNO、NNO、NNIC－D4、COTD3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4（色譜純，加拿大TRC試劑公司）。

尿液樣品來自招募的自愿者，自愿者按照自身的消費習慣抽吸卷煙，取24h尿樣，棄去晨尿，尿液收集于潔凈容器中于－18℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制分別準確稱取適量NNIC、COT、NCOT、OHCOT、CNO、COT－G、NIC－G、OHCOT－G、NNO和NIC，用甲醇配成質量濃度分別為20、300、20、400、50、200、200、200、100、300μg/mL的標準儲備液，于－18℃避光保存。

分別準確稱取適量NNIC－D4、COT－D3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4，用甲醇配制成質量濃度分別為1、2、0.2 、2、0.2 、2、2、2、1、2mg/mL的內標儲備液，于－18℃避光保存。

準確移取適量內標儲備液，用乙腈/甲醇混合溶劑（體積比3∶1）配制成NNIC－D4、COT－D3、NCOT－D4、OHCOT－D3、CNO－D3、COT－G－D3、NIC－G－D3、OHCOT－G－D3、NNO－D3和NIC－D4的質量濃度分別為1、2、0.2 、2、0.2 、2、2、2、1、2μg/mL的混合內標工作溶液，于－18℃避光保存。

準確移取適量標準儲備液于10mL容量瓶中，加入200μL混合內標工作溶液，用乙腈/甲醇混合溶劑（3∶1）配制成NNIC和NCOT的質量濃度為0.2 ～20ng/mL，CNO為0.5 ～50ng/mL，NNO為1～100ng/mL，COT－G、NIC－G和OHCOT－G為2～200ng/mL，NIC和COT為3～300ng/mL，OHCOT為4～400ng/mL的系列混合標準工作溶液，于－18℃避光保存。

1.2.2 樣品前處理尿液于室溫下解凍后取500μL，加入200μL混合內標工作溶液，用乙腈/甲醇混合溶劑（3∶1）定容至10mL，充分混合后，過0.22 μm有機相濾膜，待分析。

1.2.3 分析條件 色譜柱：Atlantis HILIC Silica柱（3.0 mm×100mm，3.0 μm）；柱溫：25℃；進樣量：10μL；流速：0.30 mL/min。流動相：A為10mmol/L甲酸銨水溶液（用甲酸調至pH3.0 ），B為乙腈；進樣前，色譜柱平衡16min。梯度洗脫程序：0～11min，95%～30%B；11～13min，30%～95%B；13～16min，保持95%B。

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；霧化氣（N2）：3.45 ×105Pa；輔助加熱氣（N2）：3.45 ×105Pa；氣簾氣（N2）：6.89 ×104Pa；電噴霧電壓：5000V；干燥溫度：500℃；掃描時間：40ms；檢測模式：多反應監測模式。煙堿及其代謝物的定量離子對（Q1/Q3）、去簇電壓（DP）、碰撞能（CE）及保留時間（RT）見表1。

表1 目標分析物及其同位素內標的質譜參數與保留時間Table1 MS parameters and retention times of the analytes and internal standards

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

尿液直接稀釋進樣是比較簡單的前處理方法。采用C18柱分離煙堿及其代謝物時，可采用水作為稀釋溶劑［13］。而采用親水作用色譜柱分離煙堿及其代謝物，水并不是理想的樣品稀釋劑，因為水的溶劑強度大于乙腈，若進樣溶劑的溶劑強度大于初始流動相，會造成色譜峰形擴展。在親水作用色譜中，乙腈是很好的樣品稀釋劑，能保證良好的色譜峰形，但部分煙堿及其代謝物的重復性較差，其中NCOT、NIC－G的相對標準偏差（RSD）大于10%，這可能是由于分析物在乙腈中的溶解度不高所致［20］。考慮到分析物能溶于甲醇，且在HILIC色譜系統中甲醇的溶劑強度小于水，因此，本實驗以乙腈/甲醇混合溶劑（體積比3∶1）為稀釋劑，考察了不同的稀釋比例（5、10、20、30倍）對目標物色譜峰形的影響。結果表明：不同的稀釋比例導致進樣溶劑的組分和分析物濃度不同，因此對色譜峰形和靈敏度均有影響。尤其是出峰較早的COT、NCOT和OHCOT的色譜峰形受樣品溶劑強度的影響較大，以COT為例（如圖1），當稀釋倍數為5和10倍時，峰擴展較嚴重，當稀釋倍數為20和30倍時，色譜峰形較好。綜合考慮分析物的色譜峰形和檢測靈敏度，最終選擇稀釋比例為20倍。

圖1 COT在不同稀釋倍數下的色譜峰Fig.1 Chromatographic peaks of COT at different dilution times

2.2 檢測條件的優化

在親水作用色譜中，為降低分析物和固定相硅醇基之間的靜電相互作用，保持流動相的pH值和固定相硅醇基離子化狀態的穩定，通常建議流動相具有一定的緩沖能力。文獻顯示，pH3.0 的甲酸銨水溶液由于其自身的緩沖能力、對高比例乙腈的互溶性和有利于提高質譜檢測靈敏度的特點，是親水作用色譜首選的流動相［20］。因此，本實驗采用pH3.0 的甲酸銨水溶液為水相流動相。

實驗對質譜條件進行了優化，由于各分析物偏堿性，所以采用正離子模式進行檢測。在正離子模式下，以流動注射的方式對各分析物的標準溶液（lμg/mL）進行全掃描，確定了各分析物的母離子（［M+H］+），然后分別以［M+H］+選擇對應的子離子（碎片），選取信號較強、無互相干擾的碎片作為定量離子。最后以多反應監測（MRM）模式優化霧化氣、輔助加熱氣、氣簾氣、電噴霧電壓和干燥溫度等質譜分析參數，優化結果見表1。在“1.2.3”分析條件下，尿液中煙堿及其9種代謝物與相應同位素內標的MRM色譜圖見圖2。

圖2 煙堿及其代謝物與同位素內標的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of nicotine，its metabolites and deuterated internal standards

2.3 方法學評價

2.3.1 基質效應 基質效應是指樣品中的背景雜質對目標物質競爭電離所致的質譜信號增強或抑制現象，會影響樣品定量的準確性。本實驗采用標準曲線測定法對基質效應進行考察，通過空白基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值進行評價，當斜率比為80%～120%時，表明基質作用較小［21］。將目標物的空白基質和純溶劑（體積比3∶1的乙腈/甲醇混合溶劑）按照“1.2.1”配成相同質量濃度的系列混合標準工作溶液，采用本方法進行分析（見表2）。結果表明：基質標準曲線的斜率與溶劑標準曲線的斜率比值為94%～110%，說明本方法的基質效應小，該前處理方法結合同位素內標能有效減少基質效應。

2.3.2 線性關系、檢出限與定量下限 采用同位素內標法進行定量，取“1.2.1 ”配制的系列混合標準工作溶液，以目標物的質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標，目標物與相應的內標峰面積比（y）為縱坐標進行線性回歸。結果顯示，煙堿及其9種代謝物在各自的質量濃度范圍內線性良好，相關系數（r）均大于0.997 。分別按信噪比（S/N）為3和10的質量濃度確定檢出限（LOD）與定量下限（LOQ），得到10種目標物的LOD和LOQ分別為0.03 ～0.24 ng/mL和0.10 ～0.80 ng/mL（見表2）。

表2 10種目標物的基質和溶劑標準曲線的線性關系、斜率比值、檢出限和定量下限Table2 Linear relations，slope ratios of ten analytes in the solvent and urine matrix，LODs and LOQs

2.3.3 回收率與相對標準偏差用空白基質加入低、中和高水平的煙堿及其代謝物標準溶液，分別考察方法在不同加標水平下的回收率。其中，中等加標水平相當于吸煙者尿液中的煙堿及其代謝物濃度。對中等水平加標樣品進行5次日內和日間平行測定，以日內和日間RSD考察方法的精密度（見表3）。結果表明，低、中、高3個加標水平下的回收率為81.9 %～110%，日內和日間RSD為0.50 %～6.7 %，符合生物樣品的分析要求。

表3 煙堿及其代謝物的日內、日間相對標準偏差及回收率Table3 Intra-day and inter-day RSDs and recoveries of nicotine and its metabolites

2.4 實際樣品的檢測

采用本方法對采集的172個卷煙消費者的尿液樣品進行檢測，結果顯示，由于所吸卷煙焦油含量不同且存在個體代謝差異，所采尿液中煙堿及其9種代謝物的質量濃度存在差異，平均質量濃度及其范圍如下：NIC、COT、OHCOT、NIC－G、COT－G、OHCOT－G、NNIC、NCOT、NNO、CNO的平均質量濃度為814.2 、1182.2 、2384.7 、603.8 、1733.3 、657.4 、33.6 、19.1 、259.7 、159.9 ng/mL，范圍分別為0～4260ng/mL、9.1 ～3580ng/mL、0～8460ng/mL、8.2 ～2180ng/mL、10.3 ～6360ng/mL、9.0 ～2373.5 ng/mL、0～137.8 ng/mL、0.4 ～60ng/mL、0～1118ng/mL、0～638ng/mL。以每種代謝物占煙堿及其代謝物總量的百分比計算，NIC為8.7 %、COT為17.3 %、OHCOT為30.4 %、NIC－G為7.9 %、COT－G為21.1 %、OHCOT－G為8.6 %、NNIC為0.4 %、NCOT為0.3 %、NNO為3.4 %，CNO為1.9 %，與文獻［14，22］報道數據的一致性較好。

3 結 論

本文建立了同時檢測人尿液中煙堿及其9種代謝物的高效液相親水作用色譜－串聯質譜法。采用體積比為3∶1的乙腈/甲醇混合溶劑將尿液樣品稀釋20倍，過0.22 μm濾膜后直接進樣分析。親水作用色譜不僅改善了分析物的峰形，且高有機相比例流動相的使用提高了質譜檢測的靈敏度。該方法前處理簡單、靈敏度高、穩定性好，適合大批量尿液中煙堿及其9種代謝物的檢測。