固相萃取/超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜法測定人參、人參葉與人參花中10種人參皂苷含量

陳樹東，胡文軍，孔祥詞，馮 銳，梁土金，崔媛媛，鐘滿霞

（1.廣東省中藥研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 523808）

人參作為傳統(tǒng)名貴中藥材，具有大補元氣、補脾益肺、生津、安神益智等功效［1］。人參皂苷作為人參的主要活性成分，在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗抑郁等神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面具有一定的藥理作用［2－3］。人參中分離鑒定了近百種人參皂苷類化合物，根據(jù)苷元結(jié)構(gòu)的不同，可分為四環(huán)三萜類結(jié)構(gòu)的達(dá)瑪烷型的原人參二醇型皂苷（PPD）、原人參三醇型皂苷（PPT）和五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)的齊墩果烷型皂苷3種類型，其中，以原人參二醇型Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3和原人參三醇型Re、Rf、Rg1、Rg2等常見的人參皂苷為主要成分［4］。目前，人參皂苷的研究主要集中在人參根部，對于人參地上部分的報道較少，有研究表明人參葉［5－8］、人參花［9－11］均含有人參皂苷類成分，甚至作為人參種植副產(chǎn)物的人參葉、人參花中的功效成分和營養(yǎng)物質(zhì)含量更高［12］。因此，有必要對人參不同部位的人參皂苷含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

人參皂苷的測定方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）［1，13－15］、液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法［16－17］、膠束電動毛細(xì)管色譜法（MEKC）［18］等，其中，MEKC法由于儀器成本和實際應(yīng)用的限制，較難普及。質(zhì)譜法檢測人參皂苷的多組分常采用四極桿和飛行時間質(zhì)譜檢測器（QTOF）［16－17］，QTOF檢測器具有高分辨率，適用于未知物質(zhì)的定性鑒別，而三重四極桿質(zhì)譜兼具靈敏度高、選擇性強的優(yōu)勢，更適用于已知物質(zhì)的定量分析；HPLC法是人參皂苷的主要檢測方法，但由于人參皂苷在紫外區(qū)的吸收較弱，如果樣品中的復(fù)雜成分未進(jìn)行有效分離，在紫外吸收的臨界波長檢測人參皂苷時，基質(zhì)中含有的大量雜峰會對檢測產(chǎn)生較大干擾。本研究根據(jù)人參皂苷的化學(xué)性質(zhì)，采用Alumina－N/XAD-2SPE Cartridge復(fù)合固相萃取柱針對性地分離和凈化樣品中的人參皂苷成分，結(jié)合超高效液相色譜?三重四極桿質(zhì)譜建立了達(dá)瑪烷型人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Re、Rf、Rg1和Rg2含量的檢測方法，并對人參、人參花和人參葉中10種人參皂苷的含量和分布情況進(jìn)行了初步研究，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用人參資源，更好控制人參質(zhì)量提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；甲酸、乙酸銨（LCMS級，上海安譜實驗科技股份有限公司）；正丁醇（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；固相萃取小柱（Alumina－N/XAD-2SPE Cartridge，1g/4g，10mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）。對照品：人參皂苷Re（批號110754－201827，下同）、Rg1（110703－201731）、Rb1（110704－201827）、Rg3（110804－201504）購于中國食品藥品檢定研究院，人參皂苷Rb2（Z99800205）、Rb3（Y8650010）、Rc（U9330025）、Rd（R7880050）、Rf（T7810020）、Rg2（47560010）購于上海安譜實驗科技股份有限公司；人參、人參葉、人參花樣品各3批，均為市售并經(jīng)本實驗室鑒別。

TSQ Quantum Access MAX三重四極桿質(zhì)譜儀、UltiMate3000高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific公司）；Sartorius CPA225D電子天平、BSA224S－CW電子天平（德國Sartorius公司）；5424R冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；MIX－1振蕩渦旋混合器（上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ－250E超聲波水浴器（昆山市超聲儀器有限公司）；實驗用水由Milli－Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件 Hypersil Gold C18色譜柱（100mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A為5mmol/L乙酸銨溶液（含0.1 %甲酸），B為乙腈。梯度洗脫條件：0～4.0 min，81%A；4.0 ～6.0 min，81%～79%A；6.0 ～8.0 min，79%～72% A；8.0 ～15.0 min，72%～69% A；15.0 ～20.0 min，69%～54% A；20.0 ～20.5 min，54%～10%A；20.5 ～22.0 min，10%A；22.0 ～22.5 min，10%～81%A；流速：0.4 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子模式（ESI－）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子傳輸毛細(xì)管溫度：350℃；電噴霧電壓：3000V；蒸發(fā)溫度：400℃；碰撞氣體壓力：0.2 Pa；輔助氣：3.6 mL/min；鞘氣：10.5 mL/min。10種分析物的監(jiān)測離子對（Q1/Q3）、碰撞能量（CE）和管透鏡補償電壓見表1。

表1 10種目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜參數(shù)Table1 Chemical structures and MS/MS parameters of ten analytes

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取各目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，用甲醇溶解并配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－18℃保存。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋，渦旋混勻，配制成質(zhì)量濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于－18℃保存。混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇－水（30∶70，體積比）配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 供試品溶液的制備提取：稱取過四號篩的樣品粉末0.2 g，精密加50mL水飽和的正丁醇，密塞，放置過夜，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣用10mL水溶解，待固相萃取凈化。

凈化：分別用20mL70%乙醇和20mL水對Alumina－N/XAD-2SPE Cartridge固相萃取柱進(jìn)行活化，取5.0 mL樣品提取溶液于已活化的SPE柱上樣，分別用20mL水進(jìn)行淋洗，用20mL70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；洗脫液用甲醇－水（30∶70）定容至25.0 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，即得；當(dāng)樣品濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線上限濃度時，采用倍量稀釋將濃度控制在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，然后測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 人參皂苷的質(zhì)譜裂解過程及條件優(yōu)化

人參皂苷的相關(guān)質(zhì)譜研究表明，實驗條件對電噴霧電離質(zhì)譜的影響較大［19－20］。本文10種人參皂苷的分子結(jié)構(gòu)均以相同的皂苷苷元和不同的糖基構(gòu)成。通過對人參皂苷電離裂解產(chǎn)生的碎片進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在ESI－模式下，原人參二醇型皂苷的準(zhǔn)分子離子在碰撞裂解時，R3位置的糖基更易斷裂，人參皂苷Rb1先后失去2個葡萄糖基（－Glc）形成m/z945.5 和783.5 兩個特征離子峰（見表1）；人參皂苷Rb2、Rb3、Rc首先斷裂失去分子量相同的阿拉伯吡喃糖基（－Arap）、木糖基（－Xyl）和阿拉伯呋喃糖基（－Araf），形成m/z945.5 的特征離子峰，再進(jìn)一步失去1個葡萄糖基，形成m/z783.5 的特征離子峰；人參皂苷Rd、Rg3在R3位置的糖基斷裂后，通過調(diào)節(jié)碰撞能量使R1位置的葡萄糖基進(jìn)一步斷裂丟失，形成m/z621.5 和459.5 的特征離子峰。而原人參三醇型皂苷質(zhì)譜的裂解過程也呈現(xiàn)相似的規(guī)律，通過分別在R3和R2位置斷裂失去葡萄糖基和鼠李糖基（－Rha），先后形成m/z637.5 和475.5 的特征離子峰。可以看出，原人參二醇型皂苷和原人參三醇型皂苷的離子碎片呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。

在確定一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰和相應(yīng)的碎片離子后，由于人參皂苷裂解所需的能量不同，實驗通過對噴霧電壓、碰撞能量和管透鏡補償電壓等條件逐步進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提升目標(biāo)物的靈敏度。后續(xù)研究中，在缺少對照品的情況下，根據(jù)人參皂苷在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律，可對其他人參皂苷的相對含量進(jìn)行分析，也可對未知人參皂苷的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷和鑒定，進(jìn)一步獲取人參皂苷的苷元、糖基和相對分子量等信息。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)人參皂苷分子結(jié)構(gòu)的碰撞斷裂規(guī)律，進(jìn)一步對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。首先通過對流動相的比較，發(fā)現(xiàn)以乙腈體系為流動相的洗脫能力優(yōu)于甲醇體系，且系統(tǒng)平衡時間相對更快。在質(zhì)譜條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，乙腈－水流動相體系中加入甲酸可提高離子化效率，增強人參皂苷的響應(yīng)信號和穩(wěn)定性；另外，添加一定比例的乙酸銨可促進(jìn)人參皂苷的離子化過程，穩(wěn)定流動相的pH值，改善部分目標(biāo)物質(zhì)的峰形和提高洗脫能力；但噪音值同步增大，最終確定乙酸銨的最佳濃度為5mmol/L。最后，通過調(diào)節(jié)梯度洗脫程序使互為同分異構(gòu)體的人參皂苷進(jìn)一步分離，由目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)可知，原人參二醇型皂苷Rc、Rb2和Rb3與原人參三醇型皂苷Rg1和Rf分別為兩組同分異構(gòu)體，雖然檢測離子碎片相同，但可通過保留時間的不同得到分離（見圖1）；而另一組保留時間接近的人參皂苷Rg3和Rg2同分異構(gòu)體，由于皂苷結(jié)構(gòu)的不同，也能通過離子碎片的不同加以區(qū)分。在優(yōu)化的色譜條件下，10種待測物質(zhì)均得到有效分離，從而實現(xiàn)準(zhǔn)確定量的目的。

圖1 10種人參皂苷的定量離子圖譜Fig.1 Quantitative ion chromatograms of ten ginsenosides

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

《中國藥典》2020年版分別只收載了人參和人參葉中人參皂苷Re、Rg1、Rb1以及人參皂苷Rg1、Re的檢測方法和質(zhì)量指標(biāo)［1］，相關(guān)地方標(biāo)準(zhǔn)也未收載人參花的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在實際檢測中，由于人參葉和人參花中含有多種皂苷和色素、氨基酸、糖類等成分，在常規(guī)液相色譜檢測中無法準(zhǔn)確進(jìn)行定量。為進(jìn)一步分離、凈化目標(biāo)物質(zhì)，本研究選擇Alumina－N/XAD-2SPE Cartridge復(fù)合固相萃取柱作為前處理的凈化柱，柱填料分別為XAD－2大孔吸附樹脂和中性氧化鋁，通過XAD－2大孔樹脂的分子排阻作用對樣品中的糖類、蛋白質(zhì)和有機(jī)酸等進(jìn)行洗脫［21］，通過中性氧化鋁對樣品中的色素、黃酮類物質(zhì)進(jìn)行吸附，從而使人參皂苷類物質(zhì)得到進(jìn)一步富集、凈化。此外，還對提取溶劑、提取工藝和提取時間進(jìn)行了優(yōu)化：研究了不同比例的提取溶劑，發(fā)現(xiàn)以水飽和的正丁醇溶液為提取溶劑對人參皂苷的提取率最高；與回流法和索氏提取法相比，超聲提取法簡單、重復(fù)性好、效果好；粉碎后的樣品分別用水飽和的正丁醇溶液提取10、20、30、40、50、60min，結(jié)果顯示，30min后提取的人參皂苷含量基本不變，因此最佳超聲提取時間為30min。優(yōu)化的固相萃取條件如“1.3.2 ”所示。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

選取人參、人參葉、人參花樣品，分別比較固相萃取前、后3種基質(zhì)對10種目標(biāo)物質(zhì)的影響，并以通過標(biāo)準(zhǔn)加入法計算供試品溶液與對照品溶液相應(yīng)濃度點的峰面積比值表示基質(zhì)效應(yīng)因子（MF），MF值越接近1，表明基質(zhì)效應(yīng)越低。結(jié)果顯示，10種目標(biāo)化合物固相萃取凈化前在人參、人參葉和人參花樣品中的MF值分別為0.819 ～0.903 、0.757 ～0.896 、0.775 ～0.923 ；經(jīng)固相萃取凈化后的MF值分別為0.945 ～0.988 、0.925 ～0.971 、0.901 ～0.979 。說明樣品經(jīng)固相萃取的分離凈化和稀釋后，較好地消除了基質(zhì)效應(yīng)，保證了定性定量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限及定量下限分別精密量取混合對照品溶液適量，用甲醇－水（30∶70）稀釋，混勻制得系列混合對照品溶液。采用本方法進(jìn)樣測定，以系列混合對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），質(zhì)譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸；并以線性方程中最低添加濃度的數(shù)據(jù)，分別根據(jù)3倍和10倍信噪比計算人參皂苷的檢出限（LOD）與定量下限（LOQ）。結(jié)果表明，10種目標(biāo)物質(zhì)均在5～2500ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）不小于0.9980 ；LOD和LOQ分別為0.25 ～2.5 mg/kg和0.75 ～7.5 mg/kg（見表2）。

2.5.2 方法回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差以人參葉為典型樣品，分別取同一批次人參葉樣品，添加適量的高、中、低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個水平做6個平行樣，按上述供試品溶液制備方法和色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，計算各人參皂苷的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。結(jié)果表明，樣品中10種人參皂苷的回收率為87.3 %～110%，RSD為1.4 %～9.3 %，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表2 10種人參皂苷的線性關(guān)系、檢出限、定量下限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table2 Linear relations，LODs，LOQs，recoveries and RSDs of10analytes

2.5.3 穩(wěn)定性取同一批次人參葉供試品溶液，分別于放置0、4、8、12、24h時進(jìn)樣測定，并計算相應(yīng)的RSD。結(jié)果表明，在24h內(nèi)10種人參皂苷的響應(yīng)值RSD均小于5.5%，表明方法穩(wěn)定性較好，滿足日常檢測需求。

2.6 實際樣品的檢測

分別取不同批次人參、人參葉和人參花樣品各3批，按上述方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，人參、人參葉和人參花樣品均能檢出10種人參皂苷，10種人參皂苷在人參根部的總量為13.44 ～20.11 mg/g，在人參葉中為56.83 ～59.81 mg/g，在人參花中為62.02 ～87.83 mg/g。除了人參皂苷Rf、Rb1外，另8種人參皂苷在人參葉和人參花中的含量更高，特別是人參皂苷Re、Rc和Rd，在人參葉和人參花中的含量顯著高于人參根部。

表3 人參、人參葉和人參花樣品中10種人參皂苷的含量（mg/g）Table3 Contents of10ginsenosides in roots，leaves and flowers of ginseng（mg/g）

3 結(jié) 論

人參的傳統(tǒng)藥用部位為根部，作為人參種植的副產(chǎn)物，人參葉和人參花大部分被遺棄，少部分以代用茶或化妝品原材料的形式被加以利用［22］。本文通過對人參與人參葉、花中的實際檢測結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)人參葉、花所含成分與人參相似，且部分人參皂苷單體和10種主要人參皂苷總量均遠(yuǎn)大于人參根部。由于人參的根和根莖的生長周期較長，通過進(jìn)一步科學(xué)、充分利用這些人參副產(chǎn)物，可以延長人參產(chǎn)業(yè)鏈，優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，同時擴(kuò)大人參藥材的使用范圍，使藥材資源利用最大化，并減少人參的需求量及森林植被和環(huán)境的破壞。