氯霉素分子印跡電化學(xué)傳感器的制備與應(yīng)用

黃象金，利健文，韋壽蓮，張華生

（1.肇慶市食品檢驗(yàn)所，廣東 肇慶 526060；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520；3.肇慶學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 肇慶526061）

氯霉素（CAP）是一種廣譜抗生素，被廣泛應(yīng)用于家禽家畜及水產(chǎn)品的細(xì)菌傳染性疾病的預(yù)防和治療［1］。然而過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物源性食品及水中殘留CAP，對(duì)人體健康造成威脅［2］。許多國(guó)家已明令禁止在食用動(dòng)物中使用CAP。但因CAP的抗菌效果好、價(jià)格低，在養(yǎng)殖業(yè)中仍存在非法使用現(xiàn)象，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中CAP殘留的檢出屢見(jiàn)不鮮。因此對(duì)CAP殘留的靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)尤為必要。

目前檢測(cè)CAP的方法主要有高效液相色譜法［3］、氣相色譜法［4］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［5－6］、酶聯(lián)免疫吸附法［7］和毛細(xì)管電泳法［8］等。上述方法普遍存在儀器昂貴，樣品前處理耗時(shí)，且難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)等局限性。電化學(xué)方法，特別是與分子印跡技術(shù)相結(jié)合后，具有較高的靈敏度和良好的選擇性，是一種快速、簡(jiǎn)單、有效的分析方法。近年來(lái)，已有關(guān)于分子印跡電化學(xué)傳感器用于CAP檢測(cè)的研究報(bào)道，如賈真真等［9］通過(guò)電聚合法在單壁碳納米管（SWCNTs）－納米銅復(fù)合物修飾電極上合成CAP印跡膜，構(gòu)建了對(duì)水溶液檢測(cè)的CAP傳感器，該方法檢出限為4.8 nmol/L。Munawar等［10］開(kāi)發(fā)了基于分子印跡聚合物（MIP）包覆銅納米粒子/碳納米管（CNTs）復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器，應(yīng)用于牛奶中CAP殘留的測(cè)定，檢出限為10μmol/L。Borowiec等［11］構(gòu)建了基于金納米粒子摻雜石墨烯修飾玻碳電極的分子印跡傳感器，對(duì)CAP的檢出限為0.59 μmol/L。但有些樣品中CAP含量很低，而上述電化學(xué)傳感器的檢出限均較高，難以滿(mǎn)足測(cè)定要求。雖然已有CAP印跡聚合物應(yīng)用報(bào)道，但該MIP主要采用單一功能單體制備，通常存在吸附容量低、選擇性不高及動(dòng)力學(xué)平衡慢等不足。已有研究表明雙功能單體制備的印跡膜因采用了兩種功能單體的組合，可增加聚合物與模板分子之間的作用力種類(lèi)和識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量，有效提高了MIP對(duì)模板分子的親和力和選擇性［12］。目前關(guān)于雙功能單體的CAP分子印跡電化學(xué)傳感器研究鮮有報(bào)道。盡管MIP在選擇性方面具有優(yōu)勢(shì)，但其在電化學(xué)傳感過(guò)程中靈敏度較低，因此各種納米材料如貴金屬［13］、石墨烯［14］、碳納米管［9－10］及氧化物［15］等常用于修飾電極以增大電極的表面積、電子傳遞速率和電催化性能，從而提高電化學(xué)傳感器的靈敏度。

本研究以CAP為模板分子，間氨基苯酚（MAP）和β-環(huán)糊精（β－CD）為功能單體，在納米氧化鋁（Al2O3）和羥基化多壁碳納米管（MWCNTs）修飾金電極表面通過(guò)電聚合法制備MIP膜，構(gòu)建了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的CAP分子印跡電化學(xué)傳感器，成功應(yīng)用于實(shí)際樣品中痕量CAP的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI600E電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；采用三電極體系，金電極（Au，直徑為2mm）為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極；掃描電子顯微鏡（SEM，德國(guó)卡爾蔡司公司）。

CAP（純度98%）、MAP（純度98%）、β－CD（純度96%）、殼聚糖（脫乙酰度≥95%），購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司；Al2O3（α相，30nm）、MWCNTs，購(gòu)于南京先豐納米材料科技有限公司；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0 ）由Na2HPO4和NaH2PO4配制；0.1 %殼聚糖溶液由1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸水溶液配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子印跡電化學(xué)傳感器的制備用Al2O3粉（0.5 μm）在濕潤(rùn)的麂皮上對(duì)Au電極打磨拋光后，用水沖洗干凈，晾干。稱(chēng)取2.0 mg Al2O3（α相，30nm）于2.0 mL0.1 %殼聚糖溶液中，超聲分散15min后，吸取4.0 μL Al2O3溶液滴涂在Au電極表面，在紅外燈下干燥后獲得Al2O3/Au電極。再取2.0 mg MWCNTs于2.0 mL0.1 %殼聚糖溶液中，超聲分散15min后，吸取6.0 μL MWCNTs溶液滴涂于Al2O3/Au電極表面，在紅外燈下干燥后得到MWCNTs/Al2O3/Au電極。將MWCNTs/Al2O3/Au電極置于含1.0 mmol/L CAP、2.0 mmol/L MAP和2.0 mmol/L β－CD的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0 ）中，在0.4 ～1.0 V范圍內(nèi)，以150mV/s速率循環(huán)伏安掃描25圈，形成CAP印跡膜。將此電極置于甲醇－鹽酸溶液（8∶2，體積比）中攪拌洗脫25min，洗脫模板分子CAP，得到CAP分子印跡電化學(xué)傳感器（MIP/MWCNTs/Al2O3/Au），制備過(guò)程如圖1所示。在相同條件下制備了非印跡電化學(xué)傳感器（NIP/MWCNTs/Al2O3/Au），除了不加模板分子CAP。

圖1 分子印跡電極的制備過(guò)程Fig.1 Schematic representation for the preparation process of molecularly imprinted electrode

1.2.2 電化學(xué)測(cè)試 采用差分脈沖伏安法（DPV）和電化學(xué)阻抗法（EIS）研究了傳感器在含0.1 mol/L KCl的5.0 mmol/L K3［Fe（CN）6］溶液中的電化學(xué)性能。將印跡電極置于一定濃度的CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育10min，取出電極，用水沖洗電極表面，洗去表面非特異性吸附的物質(zhì)。每次完成測(cè)試后，將電極浸入甲醇－鹽酸溶液（8∶2，體積比）攪拌洗脫25min，再用少量水沖洗電極表面，晾干待用。DPV表征參數(shù)：掃描電位為－0.2 ～0.6 V，電位增量為4mV，振幅為50mV，脈沖周期為0.5 s。EIS表征參數(shù)：頻率范圍為0.01 ～100kHz，振幅為5mV。

1.2.3 樣品前處理水樣取自實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水。采集時(shí)，先將管道的水流放5min，將所取水樣用0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

取市售牛奶6.0 mL于離心管中，加入10mL乙酸乙酯，渦旋混合30s后，超聲提取15min，以6000r/min離心10min，收集上清液。用5mL乙酸乙酯重復(fù)提取殘?jiān)喜⑸锨逡海?0℃下氮?dú)獯抵两伞Ｓ?mL4%氯化鈉溶液溶解殘留物，再加入5mL正己烷渦旋30s，靜置分層，棄上層正己烷液。用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0 ）定容至25mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，待測(cè)。

取市售雞飼料2.00 g于離心管中，其余前處理步驟與上述牛奶樣品處理步驟相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡膜的電聚合及形貌表征

在含1.0 mmol/L CAP、2.0 mmol/L MAP和2.0 mmol/L β－CD的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0 ）中，采用循環(huán)伏安法（CV）在MWCNTs/Al2O3/Au電極表面以150mV/s速率掃描25圈進(jìn)行電聚合制備MIP膜。由圖2A可觀察到，CAP分子印跡膜的電聚合制備過(guò)程的CV曲線(xiàn)僅在第1圈出現(xiàn)1明顯的氧化峰，但無(wú)還原峰，說(shuō)明電聚合MAP過(guò)程不可逆。隨著聚合圈數(shù)的增加，響應(yīng)電流急劇下降，最終趨于背景值，這是由于在MWCNTs/Al2O3/Au電極表面形成致密的非導(dǎo)電聚合膜，使得電極表面與溶液之間的電子轉(zhuǎn)移受到限制。圖2A插圖為不含CAP的非印跡膜電聚合過(guò)程的CV曲線(xiàn)，與電聚合制備MIP的CV曲線(xiàn)基本一致，說(shuō)明CAP在0.4 ～1.0 V范圍內(nèi)無(wú)電化學(xué)活性，在電聚合過(guò)程中其結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。為了進(jìn)一步證實(shí)MIP膜是否修飾到電極表面，采用SEM對(duì)未修飾印跡膜的MWCNTs/Al2O3/Au電極和洗脫模板分子前后的MIP/MWCNTs/Al2O3/Au電極的表面進(jìn)行表征。如圖2B所示，MWCNTs/Al2O3/Au電極表面呈現(xiàn)許多MWCNTs交錯(cuò)形成的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)既有利于電解質(zhì)離子滲透和電子傳遞，又能有效增加電極表面積。電聚合后，MWCNTs/Al2O3/Au電極表面覆蓋了一層均勻致密的聚合物膜（圖2C）。而洗脫模板分子后的MIP/MWCNTs/Al2O3/Au電極表面變得相對(duì)粗糙（圖2D），且印跡膜上形成與CAP尺寸大小、形狀及作用位點(diǎn)相匹配的印跡位點(diǎn)，使其能選擇性地吸附溶液中的CAP。

圖2 MIP的電聚合制備過(guò)程的CV圖（A），MWCNTs/Al2O3/Au電極（B）及洗脫模板分子前（C）后（D）的MIP/MWCNTs/Al2O3/Au電極的掃描電鏡圖Fig.2 CV curves of electropolymerization process for the preparation of MIP（A），SEM images of MWCNTs/Al2O3/Au electrode（B），MIP/MWCNTs/Al2O3/Au electrode before（C）and after（D）elution of template

2.2 分子印跡傳感器的差分脈沖伏安法及電化學(xué)阻抗表征

采用DPV考察了不同電極在含0.1 mol/L KCl的5.0 mmol/L K3［Fe（CN）6］溶液中的電化學(xué)行為（如圖3A）。裸Au電極的曲線(xiàn)上觀察到1明顯的［Fe（CN）6］3–/4–的氧化峰（曲線(xiàn)a）。Au電極修飾Al2O3后（曲線(xiàn)b），［Fe（CN）6］3－/4－的峰電流明顯增加，這是因?yàn)锳l2O3能增大電極表面積，有助于［Fe（CN）6］3－/4－的擴(kuò)散，提高了電極的催化活性。進(jìn)一步修飾MWCNTs后（曲線(xiàn)c），［Fe（CN）6］3－/4－的峰電流顯著增加，歸因于MWCNTs進(jìn)一步提高了電極的導(dǎo)電性及表面積，促進(jìn)電子傳遞。然而，在MWCNTs/Al2O3/Au電極表面電聚合形成印跡膜后（曲線(xiàn)d），［Fe（CN）6］3－/4－的氧化峰消失，這是因?yàn)殡姌O表面形成的非導(dǎo)電聚合物阻止了［Fe（CN）6］3－/4－在電極表面進(jìn)一步氧化。當(dāng)模板分子被洗脫后，印跡電極的曲線(xiàn)出現(xiàn)明顯的［Fe（CN）6］3－/4－的電流峰（曲線(xiàn)e），表明印跡膜上形成了大量印跡空穴，使［Fe（CN）6］3－/4－可到達(dá)電極表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)。將洗脫模板分子的MIP/MWCNTs/Al2O3/Au電極置于40.0 nmol/L CAP溶液中孵育10min后，［Fe（CN）6］3－/4－的峰電流下降（曲線(xiàn)f），原因是部分印跡空穴被CAP分子占據(jù)，減少了［Fe（CN）6］3－/4－在電極表面的擴(kuò)散通道。與印跡電極相比，由于NIP膜上缺乏印跡空穴，因而NIP/MWCNTs/Al2O3/Au電極的曲線(xiàn)顯示很弱的電流響應(yīng)（曲線(xiàn)g）。

為進(jìn)一步了解電極表面的界面特性，采用EIS對(duì)不同電極進(jìn)行表征（圖3B）。典型的阻抗譜一般在高頻區(qū)為半圓，電子轉(zhuǎn)移阻抗（Ret）等于高頻區(qū)半圓的直徑。從圖3B可見(jiàn)，Au、Al2O3/Au和MWCNTs/Al2O3/Au電極的EIS曲線(xiàn)（曲線(xiàn)a～c）近似直線(xiàn)，說(shuō)明這些電極表面的Ret非常小。當(dāng)MWCNTs/Al2O3/Au電極表面修飾印跡膜（曲線(xiàn)d）或非印跡膜（曲線(xiàn)g）后，非導(dǎo)電的聚合膜嚴(yán)重阻礙了電極界面的電子轉(zhuǎn)移，所以Ret急劇增大。洗脫模板分子后（曲線(xiàn)e），印跡電極表面留下印跡空穴，形成［Fe（CN）6］3－/4－的擴(kuò)散通道，導(dǎo)致Ret顯著減小。而吸附模板分子后的印跡電極的Ret明顯增大（曲線(xiàn)f），說(shuō)明模板分子重新堵塞了部分印跡空穴，阻礙了電子傳遞。這些結(jié)果與DPV表征結(jié)果相符，說(shuō)明所制備的印跡傳感器對(duì)CAP具有良好的印跡效應(yīng)。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 Al2O3及MWCNTs用量的優(yōu)化采用DPV考察了不同用量（0、2、4、6、8μL）Al2O3修飾電極的DPV響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Al2O3用量的增加，修飾電極的峰電流增加，歸因于電極經(jīng)Al2O3修飾后能增大電極表面積，增多電化學(xué)反應(yīng)活性位點(diǎn)的緣故。當(dāng)Al2O3用量為4μL時(shí)，峰電流最大，繼續(xù)增大Al2O3用量，電流呈下降趨勢(shì)，其原因可能是Al2O3用量過(guò)多使修飾膜厚度增加，增大了傳質(zhì)阻力。因此選擇Al2O3的最佳用量為4μL。同理，探討了不同用量（0～8μL）MWCNTs對(duì)電流響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)MWCNTs用量為6μL時(shí)，MWCNTs/Al2O3/Au電極上的DPV電流響應(yīng)最高。因此選擇MWCNTs的最佳用量為6μL。

2.3.2 功能單體的選擇及模板分子與功能單體摩爾比的優(yōu)化CAP分子結(jié)構(gòu)上含有羰基、亞胺基、羥基、硝基等極性基團(tuán)和疏水性的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，故考慮通過(guò)氫鍵作用和疏水作用這兩種非共價(jià)鍵的形式組裝模板分子與功能單體。氨基苯酚因其容易電聚合在不同的襯底上形成穩(wěn)定的聚合物而常被選作制備MIP膜的功能單體［16］。而β－CD的疏水內(nèi)腔結(jié)構(gòu)使其能作為“宿主”與諸多疏水性化合物形成穩(wěn)定的包合物，并被廣泛用作功能單體來(lái)制備MIP膜［17］。因此分別選擇MAP、MAP與β－CD作為功能單體制備了不含β－CD和含β－CD的兩種印跡傳感器，并研究了其對(duì)CAP的特異性識(shí)別性能，結(jié)果見(jiàn)圖4。研究發(fā)現(xiàn)，以MAP和β－CD為雙功能單體制備的印跡傳感器的峰電流變化（ΔI1）遠(yuǎn)大于以MAP為功能單體制備的印跡傳感器吸附CAP分子前后的峰電流變化（ΔI2），說(shuō)明使用雙功能單體制備的傳感器能吸附更多CAP分子。這可能是由于MAP的羥基和氨基易與CAP分子的極性基團(tuán)形成氫鍵，同時(shí)β－CD的內(nèi)腔通過(guò)疏水作用包合CAP分子上的苯環(huán)，兩種功能單體的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有助于提高M(jìn)IP膜對(duì)CAP的吸附能力和選擇性。因此選擇MAP和β－CD為雙功能單體制備印跡傳感器。

圖4 使用不同單體制備的印跡電極的DPV圖Fig.4 DPV curves of imprinted electrodes prepared with different monomers

模板分子與功能單體之間的比例直接影響印跡膜的印跡位點(diǎn)數(shù)量。若單體濃度太低，無(wú)法與模板分子充分結(jié)合，則導(dǎo)致形成印跡位點(diǎn)數(shù)量不足。相反，單體濃度過(guò)高則可能在電極表面形成覆蓋部分印跡位點(diǎn)的聚合物，導(dǎo)致模板分子難以洗脫。實(shí)驗(yàn)固定CAP的濃度為1.0 mmol/L，研究了不同摩爾比（1∶1∶1、1∶2∶1、1∶3∶1、1∶4∶1、1∶2∶2、1∶2∶3、1∶2∶4）的CAP－MAP－β－CD制備的傳感器對(duì)CAP吸附前后的峰電流變化。結(jié)果顯示，模板分子與單體摩爾比為1∶2∶2時(shí)，傳感器的峰電流變化最大，說(shuō)明印跡膜形成識(shí)別位點(diǎn)較多，即CAP－MAP－β－CD的最佳摩爾比為1∶2∶2。

2.3.3 掃描圈數(shù)的優(yōu)化印跡膜的厚度是影響印跡傳感器識(shí)別性能的重要因素，在電聚合過(guò)程中可通過(guò)調(diào)整CV掃描圈數(shù)來(lái)控制印跡膜的厚度。掃描圈數(shù)太少，獲得的聚合膜較薄，則形成的印跡位點(diǎn)較少，印跡膜的選擇性和穩(wěn)定性差。反之則會(huì)形成較厚的印跡膜，以致模板分子包埋過(guò)深，難以完全洗脫。實(shí)驗(yàn)通過(guò)DPV法考察了不同電聚合圈數(shù)制備的印跡電極對(duì)CAP吸附前后的電流響應(yīng)變化。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電聚合圈數(shù)為25圈時(shí)，峰電流變化達(dá)到最大值，即選擇最佳電聚合圈數(shù)為25圈。

2.3.4 洗脫劑及洗脫時(shí)間的選擇印跡膜上模板分子的洗脫程度與印跡孔穴的數(shù)量緊密相關(guān)，而洗脫條件需要將模板分子充分洗脫且不破壞印跡膜的結(jié)構(gòu)。初步選取了甲醇、乙醇、0.5 mol/L硫酸水溶液、甲醇－乙酸（9∶1）、乙醇－乙酸（9∶1）、甲醇－鹽酸（9∶1）、乙醇－鹽酸（9∶1）、0.2 mol/L氫氧化鈉水溶液為洗脫劑，發(fā)現(xiàn)甲醇－鹽酸（9∶1）的洗脫效果最佳，印跡電極孵化CAP前后的峰電流變化最大。進(jìn)而研究了甲醇－鹽酸的體積比分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4時(shí)的洗脫效果。結(jié)果顯示，甲醇－鹽酸（8∶2）的洗脫效果最好。同時(shí)還探究了印跡電極在甲醇－鹽酸（8∶2）洗脫劑中不同洗脫時(shí)間（0、5、10、15、20、25、30min）的影響。如圖5所示，隨著洗脫時(shí)間的增加，電極表面的印跡空穴增多，峰值電流逐漸增大，洗脫25min后，峰電流變化很小，說(shuō)明印跡膜上的模板分子已基本被洗脫。繼續(xù)延長(zhǎng)洗脫時(shí)間，除了影響實(shí)驗(yàn)效率外，還可能破壞印跡膜的結(jié)構(gòu)。因此選擇25min作為最佳洗脫時(shí)間。

圖5 MIP/MWCNTs/Al2O3/Au電極在不同洗脫時(shí)間下的DPV圖Fig.5 DPV curves of MIP/MWCNTs/Al2O3/Au elec?trode with different elution time

2.3.5 pH值的優(yōu)化溶液的pH值對(duì)模板分子在印跡電極表面的吸附效果有較大影響。因此在孵育階段需要優(yōu)化溶液的pH值，以促進(jìn)CAP與印跡空穴的相互作用。本實(shí)驗(yàn)分別配制了含60.0 nmol/L CAP的pH分別為5.5 、6.0 、6.5 、7.0 、7.5 、8.0 的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，研究了印跡電極孵育CAP前后的峰電流變化。發(fā)現(xiàn)pH7.0 時(shí)，峰電流變化最大，即印跡電極對(duì)CAP的吸附量最大。pH值過(guò)低時(shí)，可能是溶液中的H+與單體MAP的氨基上的孤對(duì)電子結(jié)合，破壞了MAP與CAP之間的氫鍵，導(dǎo)致CAP容易脫離印跡膜。而pH值過(guò)高時(shí)，CAP可能發(fā)生水解［18］，結(jié)構(gòu)被破壞，不利于印跡膜對(duì)CAP的特異性識(shí)別。因此選擇在pH7.0 的磷酸鹽緩沖溶液中檢測(cè)CAP。

2.3.6 孵育時(shí)間的優(yōu)化模板分子在印跡膜上的孵育時(shí)間也會(huì)影響傳感器的靈敏度。將洗脫模板的印跡電極置于60.0 nmol/L CAP溶液中分別孵育不同時(shí)間（0、1、2、4、6、8、10、12min）后進(jìn)行DPV測(cè)試。結(jié)果顯示，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，印跡電極對(duì)CAP的吸附量逐漸增加，峰電流顯著下降，超過(guò)10min后峰電流幾乎不變，說(shuō)明印跡膜對(duì)CAP的吸附達(dá)到飽和。由此確定最佳孵育時(shí)間為10min。

2.4 線(xiàn)性范圍與檢出限

在最佳條件下，將MIP/MWCNTs/Al2O3/Au電極置于不同濃度CAP溶液中孵育10min后，在含0.1 mol/L KCl的5.0 mmol/L K3［Fe（CN）6］溶液中進(jìn)行DPV測(cè)試。如圖6所示，峰電流隨CAP濃度的增加而減小，歸因于CAP在印跡膜上的吸附量逐漸增加，導(dǎo)致［Fe（CN）6］3－/4－在電極表面的擴(kuò)散道減少的緣故。CAP濃度在1.0 ～60.0 nmol/L范圍內(nèi)與［Fe（CN）6］3－/4－的峰電流（I，μA）呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為I=－0.655 c+50.88 （r2=0.996 ）。計(jì)算得到檢出限（3S/b）為0.14 nmol/L，其中S為空白溶液測(cè)定8次的峰電流的標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為校準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率的絕對(duì)值［19］。本方法的檢出限低于文獻(xiàn)報(bào)道的電化學(xué)方法（見(jiàn)表1），其原因主要有：①Al2O3和MWCNTs具有大的比表面積和良好的催化性能，其作為載體不僅有助于增強(qiáng)電流信號(hào)，而且為印跡膜的修飾提供了大的比表面積。②使用雙功能單體可增加聚合物與模板分子之間的作用力種類(lèi)和識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量，從而提高印跡膜對(duì)模板分子的親和力和選擇性。兩方面的協(xié)同作用大大提高了傳感器對(duì)CAP的檢測(cè)靈敏度。

表1 不同電化學(xué)方法檢測(cè)CAP的性能比較Table1 Comparison of different electrochemical methods for CAP detection

圖6 孵育不同濃度CAP的MIP/MWCNTs/Al2O3/Au電極的DPV圖Fig.6 DPV curves of MIP/MWCNTs/Al2O3/Au elec?trode incubated with different concentrations of CAP concentrations of CAP（a－g）：1.0 ，2.5 ，5.0 ，10.0 ，20.0 ，40.0 ，60.0 nmol/L；insert：linear relationship between peak current and concentration of CAP

2.5 傳感器的選擇性

為了考察傳感器對(duì)CAP的選擇性，實(shí)驗(yàn)選擇氟苯尼考、恩諾沙星和磺胺嘧啶3種常見(jiàn)抗菌藥物作為可能干擾物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將印跡電極分別置于40nmol/L CAP和干擾物中孵育后進(jìn)行DPV測(cè)定，得出印跡電極對(duì)CAP及上述3種抗菌藥物吸附前后產(chǎn)生的相對(duì)峰電流差值分別為25.32 、13.61 、3.78 、5.94 μA（見(jiàn)圖7）。盡管氟苯尼考的結(jié)構(gòu)與CAP類(lèi)似，但印跡電極表面的印跡空穴不能與之完全契合，相比于CAP進(jìn)入印跡空穴的量有所減少，故峰電流變化小于CAP；而結(jié)構(gòu)差異較大的恩諾沙星和磺胺嘧啶難以進(jìn)入印跡空穴，所以?xún)烧叩姆咫娏髯兓　Ｑ芯勘砻鳎M管印跡傳感器對(duì)氟苯尼考有少量的特異性吸附，但對(duì)CAP的選擇性更高，因此不影響傳感器對(duì)CAP的檢測(cè)。

圖7 MIP/MWCNTs/Al2O3/Au印跡傳感器對(duì)不同藥物的選擇性響應(yīng)Fig.7 Selectivity of MIP/MWCNTs/Al2O3/Au molecularly imprinted sensor toward different drugs

2.6 傳感器的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

取同一批制備的5支印跡電極于40nmol/L CAP溶液中孵育10min后，在含0.1 mol/L KCl的5.0 mmol/L K3［Fe（CN）6］溶液中進(jìn)行DPV測(cè)試，計(jì)算峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.9 %。使用同一支印跡電極對(duì)40nmol/L CAP溶液進(jìn)行6次重復(fù)吸附、洗脫測(cè)試，測(cè)得RSD為3.0 %，表明此印跡電極具有良好的重現(xiàn)性。將印跡電極于室溫保存，每天吸附40nmol/L CAP溶液后進(jìn)行DPV測(cè)定，再洗脫，連續(xù)測(cè)定7d，發(fā)現(xiàn)第3d和第5d測(cè)得電流響應(yīng)值分別為初始值的94.1%和91.2 %，第7d降至86.4 %，說(shuō)明該電極在6d內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.7 實(shí)際樣品分析

將建立的方法應(yīng)用于實(shí)際樣品中CAP的檢測(cè)，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為5.0 、10.0 、50.0 nmol/L，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表2。自來(lái)水、雞飼料和牛奶樣品中均未檢出CAP殘留。CAP在3種樣品中的平均回收率為88.0 %～110%，RSD小于10%。說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、可靠，能夠達(dá)到檢測(cè)痕量CAP殘留的要求。

表2 樣品中CAP的測(cè)定結(jié)果及其回收率Table2 Determination result of CAP and its recovery in real samples

3 結(jié) 論

本文以Al2O3和MWCNTs為載體，結(jié)合雙功能單體制備的印跡膜，構(gòu)建了一種用于檢測(cè)痕量CAP的分子印跡電化學(xué)傳感器。傳感器的線(xiàn)性范圍為1.0 ～60.0 nmol/L，檢出限低至0.14 nmol/L。所構(gòu)建的傳感器具有良好的靈敏度、選擇性、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性，用于實(shí)際樣品中CAP的檢測(cè)，結(jié)果令人滿(mǎn)意，為實(shí)際樣品中痕量CAP檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效的分析方法。