快速固相萃取/超高效液相色譜－串聯質譜法測定水產品中25種磺酰脲類及磺酰胺類除草劑殘留

朱富強，吳樹棟，韓巖君，郭宇鵬

（濱州市檢驗檢測中心，山東 濱州 256600）

磺酰脲類和磺酰胺類除草劑在世界農藥市場中占有重要地位，兩者應用范圍廣、用量大，對于水稻、玉米、大豆、小麥、甜菜、油菜等作物的雜草防治具有良好效果［1－3］。磺酰脲類除草劑和磺酰胺類除草劑在施用過程中易通過地表徑流和滲透進入水環境中，污染養殖水體，進而影響水體生物的生長發育，造成水產品質量安全隱患，危害消費者健康。我國農業部公告第2032號［4］規定，于2015年12月31日起全面禁止使用氯磺隆，于2017年7月1日起全面禁止使用胺苯磺隆及甲磺隆，并在GB2763－2019［5］中規定了多種磺酰脲類及磺酰胺類除草劑在食品中的最大殘留限量，但尚未制定在動物源性食品中的最大殘留限量。日本肯定列表制度中規定了動物源性食品中磺酰脲類及磺酰胺類除草劑的最大殘留限量［6］，如噻吩磺隆及苯磺隆在豬肉等肉類中的最大殘留限量為0.01 mg/kg，磺酰磺隆在魚類、軟體動物、甲殼綱動物中的最大殘留限量為0.005 mg/kg，唑嘧磺草胺在雞肉、肝臟、蛋和奶中的最大殘留限量為0.1 mg/kg。因此，建立水產品中磺酰脲類及磺酰胺類除草劑的檢測方法，對于保障進出口貿易、保護人民健康具有重要意義。

目前，文獻報道的水產品等動物源性食品中農藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）［7－8］、氣相色譜－質譜聯用法（GC－MS）［9－10］、氣相色譜－串聯質譜法（GC－MS/MS）［11－12］、液相色譜法（HPLC）［13－14］及液相色譜－串聯質譜法（LC－MS/MS）［15－16］等，樣品凈化方式通常采用固相萃取法（SPE）［17－18］和QuEChERS法等［19－20］。傳統的SPE方法操作費時、步驟繁瑣，影響結果穩定性和檢驗效率，不能滿足大批量樣品的高通量、快速檢測要求。QuEChERS法具有便捷、高效、適用范圍寬等優點，但凈化效果往往不如SPE法，且在實際應用過程中需對各吸附凈化劑（如N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠、石墨化碳黑等）以及鹽析劑的用量進行優化［15－16，19－20］。SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱使用新一代的固相萃取吸附劑，無需活化、淋洗、洗脫，可直接將提取液上樣在正壓下過濾除去雜質，實現通過式一步凈化，過程簡便、高效。本文針對不同基質類型的水產品，采用SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱凈化，以超高效液相色譜－串聯質譜（UPLC－MS/MS）法測定樣品中25種磺酰脲及磺酰胺類農藥殘留。該方法凈化效率高、操作便捷，且靈敏度高、準確性好，可為水產品中農藥殘留風險監控提供借鑒與參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I－Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ－XS三重四極桿質譜儀（美國Waters公司）；AccucoreTMaQ C18色譜柱（2.1 mm×50mm×2.6 μm，美國Thermo Fisher公司）；Shim－pack GIST C18色譜柱、MultiS－100渦旋混合器（島津（上海）實驗器材有限公司）；3－18K5離心機（德國Sigma公司）；CP225D電子分析天平（德國Sartorius公司）；Milli－Q Advantage A10超純水儀（美國Millipore公司）。

甲醇、乙腈（HPLC級，德國Merck公司）；甲酸（純度＞99%，美國ACS恩科化學公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ?cm）；SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱（5mL/5g）、SHIMSEN QuEChERS提取鹽包（含1g氯化鈉、4g硫酸鎂、0.5 g檸檬酸二鈉鹽水合物、1g無水檸檬酸鈉，島津（上海）實驗器材有限公司）；尼龍針式濾器（0.22 μm，上海安譜科技有限公司）。

標準品：醚磺隆（100μg/mL）、甲酰胺磺隆（100μg/mL）、氯酯磺草胺（100μg/mL）、玉嘧磺隆（1000μg/mL）購自AccuStandard公司；甲基噻吩磺隆、吡嘧磺隆的質量濃度均為100μg/mL，購自ANPEL公司；氟唑嘧磺草胺的質量濃度為100μg/mL，購自BePure公司；氟磺隆、氟嘧磺隆、氟胺磺隆、五氟磺草胺、雙氯磺草胺、醚苯磺隆、甲磺隆、雙氟磺草胺、氯磺隆、四唑嘧磺隆、環丙嘧磺隆的質量濃度均為100μg/mL，購自First Standard公司；苯磺隆（100μg/mL）購自農業農村部環境保護科研監測所；氯嘧磺隆的質量濃度為100μg/mL，購自北京壇墨質檢科技有限公司；咪唑磺隆、嘧啶磺隆、磺酰磺隆、乙氧嘧磺隆、胺苯磺隆的純度均≥99%，購自Dr.Ehrenstorfer公司，各準確稱取10.0 mg，用甲醇稀釋定容至100mL容量瓶中，配成質量濃度均為100μg/mL的標準儲備液，于－20℃避光保存。

1.2 標準溶液的配制

各準確移取一定量25種待測化合物標準溶液至50mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，配制成1μg/mL的混合標準中間液，于－20℃低溫保存。臨用前，用空白樣品提取液配制成系列質量濃度的基質混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

分別取草魚、鯉魚、鯽魚、克氏原螯蝦、南美白對蝦、文蛤的可食部分進行均質，準確稱取2g試樣（精確至0.01 g）至50mL離心管中，加入10.0 mL超純水，渦旋1min，再準確加入10.0 mL乙腈，渦旋提取5min，然后加入SHIMSEN QuEChERS提取鹽包，劇烈振搖1min，以8000r/min離心5min。取5mL上清液通過SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱，以1滴/s的流速加壓萃取，收集濾液，準確吸取500μL濾液與500μL超純水混合，過0.22 μm有機微孔濾膜后，待測。

1.4 色譜與質譜條件

色譜條件：Shim－pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×50mm×2.0 μm）；柱溫為40℃；進樣體積為5μL；流速為0.40 mL/min；流動相：A為0.1 %甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序為：0～2.8 min，10%～70% B；2.8 ～2.9 min，70%～95% B；2.9 ～3.9 min，95% B；3.9 ～4.0 min，95%～10% B；4.0 ～6.0 min，10%B。

質譜條件：電噴霧電離（ESI）源，正、負離子模式同時掃描；多反應監測模式（MRM）；離子源溫度：150℃；毛細管電壓：2.00 kV；脫溶劑氣溫度：600℃；脫溶劑氣流量：1000L/h；錐孔反吹氣流量：150L/h；碰撞氣流量：0.15 mL/min。25種除草劑的質譜分析參數見表1。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 質譜條件的優化 以0.1 %甲酸水溶液－乙腈（30∶70）為流動相，采用流動注射的方式，對待測化合物的質譜條件進行優化。在電噴霧正、負離子同時監測模式下，優化離子源溫度、脫溶劑氣溫度、毛細管電壓、錐孔電壓等參數，使目標物母離子的響應信號強度達到最佳，并進行二級質譜掃描，確定定性離子和定量離子，在多反應監測模式下優化碰撞能量等質譜參數。優化后的質譜參數見表1。

2.1.2 色譜條件的優化 分別考察了AccucoreTM aQ C18色譜柱（2.1 mm×50mm×2.6 μm）和Shimpack GIST C18色譜柱（2.1 mm×50mm×2.0 μm）對25種待測化合物的分離效果，結果發現采用后者作為分離柱時各待測化合物的峰響應值更高，且保留時間更為合理，故選用Shim－pack GIST C18色譜柱為分離柱。由于待測物大部分在正離子模式下測定，酸性條件有利于離子化，可增強其響應值，故流動相A相采用0.1%甲酸水溶液。比較了乙腈、甲醇作為流動相B相對目標物色譜分離行為的影響。結果表明，以甲醇作為流動相B相時，25種待測化合物的峰響應值普遍較低，且乙氧嘧磺隆、醚磺隆的峰形拖尾明顯；以乙腈作為流動相B相時，25種待測化合物的峰響應值均高于甲醇，且峰形尖銳，因此采用0.1%甲酸水溶液－乙腈作為流動相。MRM模式下25種待測化合物混合標準溶液（10μg/L）的總離子流圖（TIC）見圖1。

圖1 MRM模式下25種待測化合物混合標準溶液（10μg/L）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of25analytes mixed standard solution（10μg/L）in MRM mode

2.2 樣品提取方法的優化

本實驗嘗試采用甲醇、乙腈作為提取溶劑，結果顯示，由于水產品為高蛋白樣品，直接加入強極性有機溶劑后使蛋白質迅速失水變性，導致樣品迅速結塊，影響待測化合物的提取效率。在加入提取溶劑前，加水稀釋使樣品分散均勻有利于待測化合物的提取。

進一步以陰性草魚樣品為實驗對象，在待測化合物加標水平為10μg/kg條件下，首先加入10mL水使樣品分散，再分別加入10mL的不同提取溶劑（甲醇、1%甲酸甲醇、乙腈及1%甲酸乙腈），然后加入QuEChERS提取鹽包進行鹽析，考察各提取溶劑對待測化合物的提取效率。結果表明，經甲醇或1%甲酸甲醇提取后，鹽析效果差，無法分層，且所得提取液較為渾濁，待測化合物的回收率普遍較低（0%～45.6%），其原因可能在于甲醇水溶液對干擾物的溶解能力強，共萃物較多，影響了待測化合物的測定。采用乙腈或1%甲酸乙腈作為提取溶劑時各待測化合物的回收率均大于62%，且兩者無明顯差異。為節約成本、安全環保，最終選用乙腈作為提取溶劑。

2.3 樣品凈化方式的選擇

經乙腈提取后的樣品溶液中含有大量磷脂等脂溶性化合物，會干擾待測化合物測定，且影響儀器性能。為降低基質干擾，提高方法的準確性和靈敏度，減少對色譜柱、質譜檢測器的污染，須對樣品進行有效的凈化處理。SHIMSEN QVet固相萃取柱包括QVet－AG+、QVet－HP+、QVet－NM+等型號，前兩者主要應用于高極性化合物，后者的適用范圍寬，可應用于不同類型化合物的凈化。考慮到待測化合物的理化性質，因此選擇SHIMSEN QVet－NM+快速固相萃取柱對提取液進行凈化。采用通過式固相萃取凈化策略，將5mL樣品提取溶液直接加載至固相萃取柱以除去磷脂等雜質，過程簡便、快速、高效。為考察其凈化效果，參考文獻［21］的方法，通過采集m/z184前體離子，得到磷脂類化合物的含量信息。圖2為經SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱凈化前后空白草魚樣品溶液的m/z184的TIC圖，可見，經凈化后有效去除了磷脂類化合物，表明該方法的凈化效果顯著。

圖2 采用快速固相萃取柱凈化前（A）和凈化后（B）的空白草魚樣品檢測效果比較Fig.2 Comparison of blank grass carp samples before（A）and after（B）rapid solid phase extraction

2.4 進樣溶劑的優化

凈化后所得濾液的溶劑為乙腈，將濾液直接上機測試，發現所有待測化合物的峰形較寬、峰前拖尾，峰面積重現性較差，其原因為樣品溶劑的洗脫強度大于流動相的洗脫強度，溶劑效應導致峰變形及柱效降低。本文采用稀釋法減小溶劑效應，經試驗發現，取500μL濾液與500μL超純水混合后進樣分析，所有待測化合物的峰形均正常，且不會對檢出限造成較大影響，故最終采用將濾液用超純水稀釋1倍后進樣分析。

2.5 樣品基質效應的考察

在LC－MS/MS分析中，基質效應（ME）是影響定性定量結果準確性的重要因素之一。計算公式為：ME=（基質匹配校準曲線斜率/溶劑配制校準曲線斜率－1）×100%［22］。|ME|＜20%為弱基質效應，20%≤|ME|≤50%為中等程度基質效應，|ME|＞50%為強基質效應。由表2可知，25種待測化合物在草魚、南美白對蝦、文蛤中均表現為基質抑制效應（ME＜0）；在草魚基質中，玉嘧磺隆、氯磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆表現為中等程度基質效應；在南美白對蝦基質中，苯磺隆、玉嘧磺隆、磺酰磺隆、甲磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆表現為中等程度基質效應；在文蛤基質中，氟唑嘧磺草胺、甲基噻吩磺隆、苯磺隆、醚磺隆、磺酰磺隆表現為中等程度基質效應。其余待測化合物在草魚、南美白對蝦、文蛤基質中均為弱基質效應。為確保結果準確性，選擇基質匹配標準溶液外標法進行定量分析。

表2 25種待測化合物在草魚、南美白對蝦及文蛤中的基質效應Table2 Matrix effects（ME）of25analytes in grass carp，penaeus vannamei and meretrix meretrix

2.6 線性關系與檢出限

分別采用草魚、南美白對蝦、文蛤空白基質溶液配制質量濃度為0.20 ～50μg/L的混合標準工作溶液，按照前述的儀器條件進行測定，以待測化合物的質量濃度為橫坐標（X，μg/L），峰面積響應值為縱坐標（Y）建立標準曲線。并以不同加標水平下空白基質樣品的儀器響應為基準，按信噪比S/N=3計算檢出限（LOD），S/N=10計算定量下限（LOQ）。在3種空白樣品中，25種待測化合物在0.20 ～50μg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數（r2）均大于0.994 ；LOD為0.30 ～1.3 μg/kg，LOQ為1.2 ～5.0 μg/kg。以草魚空白基質為例，結果見表3。

表3 草魚空白基質中25種待測化合物的線性方程、相關系數、檢出限、定量下限、回收率及相對標準偏差（n=6）Table3 Linear equations，correlation coefficients（r2），LODs，LOQs，recoveries and RSDs（n=6）of25analytes in blank grass carp

2.7 加標回收率與相對標準偏差

取草魚、南美白對蝦、文蛤空白基質樣品，進行低、中、高3個濃度水平的加標回收實驗，按上述實驗條件進行測定，每個加標水平平行分析6次，計算各目標物的回收率和相對標準偏差（RSD）。結果表明，該方法在草魚空白基質中3個加標水平下的回收率為62.7 %～117%，RSD為1.5 %～18%；在南美白對蝦空白基質中的回收率為66.1 %～122%，RSD為1.8 %～17%；在文蛤空白基質中的回收率為76.4 %～115%，RSD為0.72 %～11%。以草魚為例，各待測化合物的回收率和RSD見表3。

2.8 實際樣品的測定

應用本方法對本實驗室在監督抽檢中留存的10份水產品（包括草魚、鯉魚、鯽魚、克氏原螯蝦、南美白對蝦、文蛤）進行了測定，結果顯示所有樣品均未檢出待測化合物。

3 結 論

本文結合快速固相萃取技術，以超高效液相色譜－串聯質譜建立了水產品中25種磺酰脲類和磺酰胺類農藥殘留的分析方法。該方法前處理簡便快速、凈化效果顯著，且靈敏度高、準確性好，能夠準確地對水產品中上述25種農藥殘留進行定性定量分析，為水產品等動物源性食品中農藥殘留的監測與控制提供了一種新的可行途徑。