堿酸處理鈦基鉭涂層對兔骨髓間充質干細胞生物學活性的影響*

崔建通 母曉丹 黃 萌 黑俊皓 賀慧霞

金屬鉭由于其優異的抗腐蝕性和生物相容性，正愈來愈多的應用于人工關節和椎間植入物，展示出較為理想的骨結合特性，并在口腔人工種植牙領域廣受關注，而鉭表面活性是醫學領域關注的焦點［1,2］。已有研究表明鉭涂層表面容易形成穩定且惰性的五氧化二鉭層，影響其與細胞和組織的結合，因此進一步活化鉭涂層表面，賦予其表面生物活性是必要的［3］。其中NaOH堿溶液處理可提升金屬鈦鉭表面生物活性，能夠在其表面形成弱堿性的生物活性涂層，可以加速模擬體液中離子在其表面上的自發成核，從而促進類骨質結構的形成，進而調節細胞的生物學功能［3］。有研究發現鈦片經NaOH處理后，表面可形成弱堿性生物鈦酸鹽涂層，再經低濃度0.5mmol/L HCl酸處理后去除其表面的鈉離子，有助于進一步增強鈦種植體的生物活性［4,5］，而鉭涂層經堿酸處理后表面形貌、成分變化以及對細胞功能的影響尚未見報道。

本研究是在前期等離子噴涂制備鈦基鉭涂層的基礎上，進一步研究堿和酸處理后涂層表面理化特性變化及其對兔骨髓間充質干細胞（rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, rBMSCs）生物學活性的影響，以提高鈦鉭人工種植體的骨結合，為推動鈦鉭人工種植體臨床轉化研究奠定基礎。

1.材料與方法

1.1 材料與分組 主要材料、試劑和設備：鈦基鉭涂層片（華南理工大學提供）規格：厚度1mm，直徑分為5mm、10mm兩種，鉭涂層厚度約120μm，采用真空等離子噴涂（VPS）技術制備。新西蘭兔（解放軍總醫院動物中心購買），胎牛血清（四季青，中國），0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國），低糖DMEM培養基（Gibco，美國），牛血清白蛋白（Sigma，美國)，CCK-8（碧云天，北京），細胞總RNA提取試劑盒（索萊寶，北京），逆轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒（Novoprotein，上海），BCIP/NBT堿性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ALP）顯色試劑盒（碧云天，北京）。場發射槍掃描電子顯微鏡（Zeiss Merlin SEM，英國），能量色散X射線光譜儀（EDS，Oxford Instruments，英國），酶標儀（TECAN infinite M200pro，瑞士），熒光顯微鏡（尼康，日本），PCR擴增儀（Bio-RadCFX96，美國）。

實驗分組如下：鈦基鉭涂層片為（Ta）組:未做特殊處理；酸處理（HCl）組:鉭涂層片浸入0.5mmol/L HCl 0.5h；堿處理（NaOH）組：鉭涂層片浸入60℃0.5mol/L NaOH 24h；堿酸依次處理（NaH）組：先浸入60℃0.5mol/L NaOH 24h 后再浸入0.5mmol/L HCl 0.5h。其中NaOH和HCl濃度建立依據課題組前期研究基礎及參考相關文獻［6-8］，各組處理后去離子水震蕩清洗20min，Co60消毒滅菌備用。

1.2 材料表面表征 分組同上，各組試件經丙酮，無水乙醇，去離子水各震蕩清洗20min，徹底烘干后，場發射槍掃描電子顯微鏡（Zeiss Merlin SEM，英國）在5KV電壓下觀察試件表面形態，并通過配套能量色散X射線光譜儀（EDS，Oxford Instruments，英國）對涂層表面100平方微米區域相關元素進行分析。

1.3 材料表面蛋白質吸附試驗 牛血清白蛋白（Sigma，美國）加去離子水配置成2mg/ml溶液。將10mm直徑鉭涂層片按上述分組分別置于48孔板中，每組4個復孔。然后將配好的200μl蛋白溶液加載到每個樣品涂層表面，37℃孵育2h，依次轉移至新的24孔板中，PBS洗3次，加200μl 2% 十二烷基硫酸鈉（Sigma，美國）振蕩孵育2h，經酶標儀（TECANinfiniteM200pro，瑞士）檢測波長562nm處的OD值。采用BCA蛋白質檢測試劑盒（碧云天，中國)，根據標準曲線計算每個樣品上吸附的蛋白總量。

1.4 rBMSCs培養擴增 細胞來源于兔骨髓原代培養，所用動物新西蘭大白兔12只，經解放軍總醫院動物中心購買，通過院倫理委員會審批（批準號：2021-x17-13）。取2周齡新西蘭兔股骨，采用全骨髓貼壁法獲取rBMSCs。主要步驟如下：無菌條件下,咬骨鉗去除股骨兩端皮質,采用加青霉素/鏈霉素的低糖DMEM培養基沖洗骨髓腔，收集后以1000轉/分鐘離心5min，取下層沉淀物，用含20%胎牛血清，100mg/L鏈霉素和100U/mL青霉素的低糖DMEM培養基重懸，移至孵箱（5% CO2、37℃）中培養。細胞生長達培養皿底面積80%～85%時，用0.25% 胰蛋白酶消化、傳代備用。成脂誘導時細胞培養在含胎牛血清（10%）、IBXM（0.5mmol/L）、地塞米松（0.1μmol/L）、吲哚美辛（100μmol/L）、胰島素（10μmol/L）、青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100mg/L）的DMEM培養基。成骨誘導時細胞培養在含胎牛血清（10%）、維生素C（50μg/ml）、β-甘油磷酸鈉（20mmol/L）、地塞米松（100nmol/L）、青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100mg/L）的DMEM培養基。細胞以3×105個/mL密度接種在6孔板，生長至孔板底面積約85% 時進行成脂誘導、成骨誘導；每3d換液，誘導14d、21d分別進行油紅O和茜素紅染色觀察。

1.5 免疫熒光檢測材料表面rBMSCs黏附 取第2代rBMSCs以5×104個/孔分別接種在直徑10mm的不同處理的各組鉭涂層鈦片表面，置孵箱培養4h，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定，按照說明書采用羅丹明標記的鬼筆環肽（索萊寶，北京）和DAPI（碧云天，北京）免疫熒光染色，熒光顯微鏡（尼康，日本）觀察細胞在各組材料表面的黏附情況。

1.6 CCK-8檢測rBMSCs在材料表面增殖 按照前述分組，將直徑5mm各處理組材料置于96孔板，將第2代rBMSCs以3×103個/孔接種在材料表面，按照CCK-8說明書操作，分別在1d、3d、5d加入CCK-8工作液（培養基：CCK-8=10∶1）孵育1h，酶標儀檢測波長為450nm處的OD值。

1.7 ALP、茜素紅檢測rBMSCs在材料表面成骨分化 取第2代rBMSCs以2×104個/孔密度接種在不同處理的4組鉭涂層表面，24h后進行成骨誘導，每3d換液。成骨誘導14d后按照BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天，北京）進行ALP染色。誘導21d，PBS沖洗后經4%多聚甲醛固定30min，隨后每孔加入1mL茜素紅染液染色10min。再次經PBS沖洗后，觀察各組染色情況。

1.8 RT-qPCR檢測rBMSCs在材料表面成骨相關基因表達 取第2代rBMSCs以5×104個/孔的密度接種在直徑10mm的4組材料表面，每組5個樣本，細胞生長達80%后同前方法成骨誘導。在第4和7天收集材料表面生長的細胞，取細胞內RNA，測定其濃度并反轉錄獲得cDNA,配置20μl反應體系，按照95℃預變性1min，而后95℃20s，60℃1min循環40次進行PCR反應,從而測定成骨相關基因Runx2和COL-I的表達水平。GAPDH作內參，引物如表1所示。

1.9 統計分析 實驗數據均以平均值±標準差表示。本研究使用GraphPad Prism 7軟件對結果采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和隨機區組設計的兩因素方差分析（Two-way ANOVA）進行統計分析，P<0.05表示有顯著性差異。

2.結果

2.1 材料表面理化及生物特性分析SEM顯示不同處理組表面形態略有不同（圖1）。各組鉭涂層呈現粗糙的表面結構，SEM和EDS顯示HCl組涂層表面形貌和元素組成未見明顯改變。高倍鏡下NaOH組涂層相對更加致密，而NaH組涂層呈現出大小不等的孔隙結構。能譜儀檢測各組材料表面成分結果顯示各組表面的元素成分相似，NaOH組表面沉積大量的鈉元素，而NaH表面鈉元素明顯減少（圖2）。血清白蛋白吸附實驗結果顯示Ta組、HCl組和NaOH組之間的血清白蛋白吸附能力無顯著差異（P>0.05），NaH組血清白蛋白吸附多于其它組（P<0.05）（圖3）。

圖2 EDS分析各鉭涂層表面元素組成A:Ta;B:HCL組;C:NaOH組;D:NaH組

圖3 血清白蛋白加載2h在不同鉭涂層表面的吸附情況*代表與Ta組比較P<0.05，其余與Ta組無差異

2.2 rBMSCs 鑒定rBMSCs 形態呈典型的長梭形，如圖4A 所示。油紅O 染色可見細胞內出現紅色脂滴，如圖4B 所示。茜素紅染色結果顯示rBMSCs 經成骨誘導后可形成礦化結節，如圖4C所示。

圖4 rBMSCs培養與鑒定A:第2代細胞形態;B:14d油紅O染色;C:21d茜素紅染色（標尺100μm）

2.3 細胞在材料表面黏附和增殖 細胞接種在4 組材料表面，經羅丹明標記鬼筆環肽染色的細胞骨架結構呈現紅色，而胞核經DAPI 標記呈藍色熒光。細胞接種在鉭涂層表面均展示出良好的伸展狀態。但細胞在不同鉭涂層處理組表面黏附有所不同，其中在NaOH 組和NaH 組細胞黏附明顯較多（圖5）。進一步CCK-8 檢測細胞在四組材料表面增殖結果如圖6所示，各組間第1d增殖無差異（P>0.05）, 第3d、5d NaOH 組和NaH 組較Ta 組和HCl組細胞增殖顯著增加（P<0.05）。

圖5 細胞在不同處理組涂層表面黏附情況，細胞骨架為羅丹明標記鬼筆環肽染色，細胞核為DAPI染色（標尺100μm）

圖6 CCK-8檢測細胞在不同鉭涂層表面增殖情況**代表與Ta組比較P<0.01，#代表與NaOH組比較P<0.05

2.4 ALP染色及茜素紅染色 第2代rBMSCs接種在材料表面14d，ALP染色結果如圖7所示，與Ta組和HCl組相比，NaOH組和NaH組出現明顯的藍色或灰黑色的ALP染色顆粒，其中NaH組的著色顆粒明顯多于NaOH組。第2代rBMSCs接種21d，各組材料表面茜素紅染色結果如圖8所示，與Ta組和HCl組相比，NaOH組和NaH組均有紅染的鈣化結節，其中NaH組鈣化結節比NaOH組呈現出更深染的紅色。

圖7 成骨誘導14d各涂層表面ALP染色情況A:鉭涂層;B:HCl組;C:NaOH組;D:NaH組

圖8 成骨誘導21d各涂層表面茜素紅染色情況A:Ta;B:HCl組;C:NaOH組;D:NaH組

2.5 RT-qPCR 檢測rBMSCs 在材料表面成骨相關基因表達 接種rBMSCs 于材料表面4d 和7d 后的成骨相關基因表達結果如圖9 所示。Ta 組和HCl 組Runx2、COL-I 基因表達無顯著差異（P>0.05）。而NaOH 組和NaH 組這兩種基因的表達水平均明顯高于另兩組（P<0.05），與NaOH 組相比，NaH 組Runx2、COL-I基因的表達水平更高（P<0.05）。

圖9 各組rBMSCs 成骨分化相關基因的表達情況（*代表與Ta組比較，*P<0.05,**P<0.01）

3.討論

鉭金屬因其優異的抗腐蝕性能以及良好的生物活性受到越來越多的關注，已在人工種植牙領域廣為研究，其中在鈦種植體表面建立鉭涂層以增加其生物活性和抗腐蝕性、發揮更好促進骨結合性能成為種植體表面改性研究熱點之一［9］。而種植體表面形貌和化學成分是影響種植體骨結合的兩個重要特性［10,11］。研究證明，堿酸處理能使鈦種植體表面發生化學改變并改善其表面形貌特征，從而提高其生物活性，誘導成骨發生［12,13］。但堿酸處理對金屬鉭表面形貌與化學成分及其生物活性有何影響，目前研究不多，而鉭經等離子噴涂制備成鈦基鉭涂層后再堿酸處理，對其表面特性有何影響尚未見報道。

前期研究表明，NaOH 處理金屬鈦或鉭能夠提升鈦或鉭的生物活性，可在表面形成穩定的無定形或晶態的弱堿性鈦酸鹽或鉭酸鹽混合物，通過離子交換吸引鈣磷離子，有效提升其在模擬體液中的成核能力，促進表面羥基磷灰石的形成，促進細胞在其表面的黏附增殖［14］。然而Fawzy 等研究發現鈦種植體經10mol/L NaOH 處理后，再經0.5mmol/L HCl處理去除其表面鈉離子能夠促進其表面磷灰石的形成，促進成骨效果更佳，將鈦人工種植體植入兔脛骨2 周后推出實驗發現堿酸依次處理組的骨界面抗剪切力為單純堿處理組的1.5倍［6］。本實驗也發現rBMSCs在堿和堿酸次序處理后的鉭涂層呈現出較強的黏附水平，而細胞黏附是人工種植體表面與組織細胞反應的第一步，在骨整合中起著關鍵作用，增加種植體表面的細胞黏附繼而促進細胞生長分化和骨結合至關重要。本研究CCK-8 實驗也證實，堿酸各處理組對細胞增殖的影響也隨培養時間延長而增加，細胞接種在材料表面1d、3d、5d NaOH 組和NaH 處理組細胞增殖速度增加，這提示堿和堿酸處理后在其表面可能形成了具有一定生物活性的鉭酸鹽涂層，促進了細胞的黏附和增殖。此外實驗還發現堿處理后繼而酸處理的涂層表面不僅鈉元素明顯減少，而且對帶負電荷的蛋白吸附增多，推測堿處理后再HCl酸處理在去除鈉元素的同時改變了鉭涂層表面的電勢能和電荷性質，使其帶部分正電荷。由于血清白蛋白能為細胞附著提供結構框架發揮重要作用［15,16］，推測電荷改變同樣有利于細胞黏附，而后續各組材料表面電勢能及電荷變化有待于進一步研究明確。

種植體表面微納米級粗糙結構能夠有效增加材料與骨的接觸面積，為細胞的黏附生長提供有利的微環境，利于細胞外基質的形成［17,18］。在眾多種植體表面形貌改性方法中，酸堿處理被認為是一種簡單有效的改性方法，可在鈦、鉭表面形微納米孔隙結構，提高其親水性及生物活性，有助于成骨細胞在其表面黏附生長以及進一步促進骨結合［19,20］。本實驗中，0.5mol/L NaOH 處理后，鉭涂層表面的孔隙增加，與Ta 組和HCl 組比較，rBMSCs 在NaOH 處理的涂層上表現出更強的黏附增殖能力，這也驗證了微米形貌的變化對細胞黏附增殖的促進作用。不僅如此，Camargo 等［8］將噴砂后的鈦種植體浸入60℃的5mol/L NaOH 溶液處理24h，SEM 顯示其表面形貌發生亞微米級（200nm）結構的改變，體外實驗發現堿處理促進了其在模擬體液中的成核反應。進一步將種植體植入大鼠脛骨8周, 與未處理組骨結合率50.6±15.3%相比，堿處理組種植體骨結合率提升至62.0±15.0%。同樣，Miyazaki 等［7］發現0.5mol/L NaOH 處理鉭片后表面形成的縫隙樣形態更利于羥基磷灰石的形成，表現出更優異的生物活性。需要指出的是：鉭金屬具有較強的抗腐蝕性能和耐酸性能，低濃度0.5mol/L NaOH 和0.5mmol/L HCl處理既避免產生涂層降解、影響涂層與基體的結合、離子釋放和腐蝕產物導致細胞凋亡等問題，又使涂層表面形成的孔隙相對均勻，增加了rBMSCs 在其表面黏附和增殖，提升了鉭涂層表面的生物活性。

現已明確骨組織形成過程的關鍵步驟包括細胞增殖、成骨分化、胞外基質分泌以及基質礦化［21］。ALP是骨形成過程中成骨細胞的標志性活性酶，而鈣結節的形成大小和多少可直觀反映細胞成骨分化的礦化程度［22］。本實驗發現堿酸次序處理后鉭涂層表面細胞內ALP 形成更多的深染藍色沉淀，茜素紅染色也顯示出更多成磚紅色染色的細胞基質礦化結節，提示堿酸次序處理后表面礦化程度更高，更能有效誘導細胞的成骨分化。成骨相關基因的表達水平是基因水平檢測成骨細胞分化的關鍵指標，本研究中對生長在不同材料表面細胞的成骨相關基因Runx2 和COL-I 的表達分析發現，與Ta組和HCl 組比較，NaOH 和NaH 組細胞在材料表面培養4d 和7d，其Runx2和COL-I等基因表達均顯著升高，而后者較前者升高更明顯。Runx2 是早期階段表達、成骨細胞分化所必需的轉錄因子［23,24］；COL-I 則是成骨細胞早期骨向分化的標志性蛋白，也是骨基質的主要成分和礦化物形成所必需的核心，參與骨組織基質形成和礦化［25］。可見細胞在材料表面黏附、增殖后在第4d 即開始向成骨分化，也進一步證實了堿酸處理后的鉭涂層的成骨誘導潛能，提示材料表面形貌和化學成分改變有效的刺激了rBMSCs 向成骨細胞分化，使其表達成骨相關基因并形成礦化基質和無機物沉積。

本實驗通過堿酸次序處理成功改變了鈦基鉭涂層表面的化學成分和形貌，有效促進了蛋白吸附，促進了細胞在涂層表面的黏附、增殖以及成骨分化，證明該法是一種簡單、有效的鉭涂層表面改性方法，可用于鈦基鉭涂層人工種植體的表面處理，為其臨床轉化研究奠定基礎。然而目前酸堿處理方法眾多，尚無統一的處理方法，對于鉭涂層的處理尚需進一步實驗探索包括酸堿濃度、處理溫度、制備氣壓等最佳處理參數，在使涂層達到最佳生物活性的同時不損害涂層的結合強度。此外其在體內的骨誘導作用及骨形成能力也仍需進一步實驗驗證。