一漢族先天性核型白內障家系的基因突變研究

李靖巖

（沈陽醫學院，遼寧 沈陽 110034）

0 引言

先天性白內障為一種常見的視力缺陷疾病，多見于嬰幼兒，指出生一年內出現的晶體混濁，可引起視力損傷，嚴重者或失明。該疾病臨床分型復雜,根據晶體渾濁形態、部位的不同可分為前極性白內障、后極性白內障、全白內障、粉塵狀白內障及板層白內障等。在所有白內障病例中，約1/3可遺傳,其中常染色體顯性遺傳（AD）為最常見的遺傳方式，也可見常染色體隱性遺傳（AR），少數為X連鎖隱性遺傳。遺傳性先天性白內障的致病基因復雜多樣，具有明顯的遺傳異質性。目前研究與報道證實該病與80余個基因相關：如編碼晶狀體蛋白的CRYAA、CRYBB1-3、CRYBA1、CRYGC、CRYGD等 基 因[1-5]；編碼縫隙連接蛋白的GJA3、GJA8等基因[6-7]；編碼轉錄調節因子基因PITX3、PAX6等[8-9]，且新的致病基因不斷被篩選出來。本研究對一個先天性核型白內障核心家系進行了基因捕獲測序,發現在家系所有患者均攜帶一晶狀體蛋白基因突變(CRYAB c.59C>G,p.P20R),為該家系的致病突變。

1 材料與方法

1.1 家系材料

家系先證者為男性，17歲，2016年2月初因視力模糊到沈陽市第四人民醫院眼科就診，臨床診斷為先天性核型白內障,2周后內進行人工晶體植入術，現視力恢復。患者家長口述該患兒幼年發病，1歲發現患兒視物不清，癥狀隨年齡增長逐年加重。該患者有一雙胞胎弟弟，癥狀與發病年齡相似。家系中患兒的母親早期也表現為類似眼部癥狀，已接受人工晶體置換手術。患兒父親未發現眼部異常癥狀和體征。本研究所涉及所有家系成員外周靜脈血抽取及DNA樣本提取已獲學院醫學倫理管理委員會簽署批準意見,且已獲得全體家系成員簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑

采用美國Qiagen 公司生產的血樣DNA提取試劑盒從外周血中提取基因組DNA。用于一代測序驗證所用引物由上海生工生物技術有限公司合成，包裝液濃度為100 μmol/L，十倍稀釋成工作液，濃度為10 μmol/L。dNTP 混合液（4種堿基各2.5mmol/L）為大連寶生物公司生產。DNA聚合酶及配套反應緩沖液購自大連寶生物公司：TaKaRa rTaq（5 U/μl），配套使用10×PCR Buffer（Mg2+Plus）。

1.3 基因突變篩查

查閱OMIM（http://www.omim.org/）及Pubmed最新文獻報道，確定81個單純性及綜合征性先天性白內障相關基因外顯子及側翼20bp序列和轉錄非翻譯區為目的捕獲區域，提交Life Technologies 公司進行引物設計。81個單純性及綜合征性先天性白內障相關基因見表1。

表1 先天性白內障高通量測序Panel基因列表

1.4 觀察指標

根據Life Technologies公司回報的可疑基因突變位點進行分析，利用NCBI基因數據庫比對并排除SNP可能性后,初步確定該家系致病基因突變，并針對該突變位點設計PCR擴增引物，對該核心家系中所有成員和100位正常人DNA樣本進行包含突變位點基因短序列的PCR擴增，隨后對擴增產物進行Sanger DNA測序驗證,判斷突變與家系表型是否共分離。利用人類基因突變數據庫（HGMD）查詢檢測到的致病基因突變是否為已報道突變或全新突變位點。

1.5 分析軟件及常用數據庫

1.5.1 基因組序列信息數據庫

NCBI database（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），UCSC Genome（http://www.genome.ucsc.edu/）

1.5.2 引物設計軟件

Primer Premier 6.0

1.5.3 DNA測序峰圖查看軟件

Chromas 2.0

1.5.4 已報道疾病相關基因突變數據庫

The Human Gene Mutation Database（HGMD）(http://www.hgmd.cf.ac.uk/)，Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）(http://www.omim.org/)。

2 結果

Ion AmpliseqTM 二代測序發現，家系中兩個患兒及患兒母親的DNA樣本在CRYAB基因1號外顯子第59位堿基均發生了C>G雜合突變（圖1）,導致該基因編碼的αB晶體蛋白第20位氨基酸殘基由精氨酸取代了原有的脯氨酸，家系中表型正常的患兒父親和100例表型正常對照者中均未有該突變檢出。另外,在NCBI、UCSC等相關基因數據庫中未發現存在相同的SNP，排出了單核苷酸多態性可能。通過查詢人類基因突變數據庫（HGMD）證實，該點突變為已報道突變，可導致不同臨床類型的先天性白內障的發生。利用NCBI基因數據庫對該突變位點氨基酸序列的保守性進行分析，結果顯示P20位點在各物種具有高度保守性（圖2）。

圖1.家系患者CRYAB基因Sanger測序驗證結果

圖2.αB晶體蛋白在P20位點的氨基酸序列高度保守

3 討論

晶體蛋白主要包括α、β、γ三類，編碼晶體蛋白的基因主要有CRYAA、CRYAB、CRYBA1-4、CRYCC、CRYDD、CRYGA、CRYGB、CRYGC、CRYGD等。晶體蛋白基因突變不僅導致其編碼蛋白的一級結構及空間結構異常,還會降低晶體蛋白的溶解性而導致晶體混濁。

Liu等[10]在2006年報道，P20S突變可導致先天性后極性白內障。αB晶體蛋白是晶狀體中重要的蛋白組分，屬熱休克蛋白，是從低等生物如細菌，到高等哺乳動物普遍存在的一種熱應激性蛋白。機體處于高溫時，機體會被激發合成此種蛋白。許多熱休克蛋白具有分子伴侶作用，可指導與協助晶體蛋白空間構像的正確折疊。αB晶體蛋白突變還可能影響其與αA晶體蛋白相互作用，從而引起顯性負效應，導致患兒在晶體發育早期形成白內障。另外，αB晶體蛋白突變還可導致其抑制晶體上皮細胞凋亡功能受損,從而導致白內障的發生。

本研究中發現的錯義突變位于CRYAB基因，該基因編碼αB晶體蛋白，位于11號染色體，D11S4176-D11S908區域，含3個外顯子。αB晶體蛋白一級結構全長175個氨基酸，其中P20位點在各物種間高度保守,表明該位點編碼的氨基酸在維持蛋白質空間構像和功能方面具有重要意義。

由于αB晶體蛋白與αA晶體蛋白可相互作用，所以我們推測，攜帶P20S突變的αB晶體蛋白可能以顯性負效應的方式作用干擾αA晶體蛋白，從而導致攜帶該突變的患者在胚胎發育早期發生晶體蛋白排列干擾，進而導致晶體透明度下降。另外，突變α晶體蛋白不再具有調控晶體上皮細胞凋亡的功能，導致晶體上皮細胞正確排列受到干擾，引起晶體透明度的下降。Li H等的報告也證實了白內障引起P20S突變αB晶體蛋白對其伴侶活性的影響α晶體蛋白與人晶狀體上皮細胞凋亡[11]。近期研究表明，P20S突變導致了αB晶體蛋白一級結構的改變，進而影響該蛋白的二級空間結構，可增加α-螺旋和減少β-片層結構，同時三級結構也可發生變化，從而影響蛋白質分子的穩定性和空間構象，誘導聚集體的形成[12]。我們推測，P20R突變還可能改變了該蛋白的親水性和等電點，導致突變蛋白的溶解度降低，導致蛋白質自聚集，并引發更穩定的αA晶體蛋白雜合多聚體。此外，該突變還可能影響到αA晶體蛋白的分子伴侶功能，從而進一步促進患者白內障的發展。

本研究采用的基因突變篩查技術主要為基于illumina平臺的二代測序技術。第二代DNA測序技術是對第一代測序技術的劃時代變革。第一代測序技術具有高達99.999% 的準確率，但不足之處是測試速度慢、通量低、成本高昂等。以往的致病基因連鎖分析及一代DNA測序策略在面對大量的患者DNA樣本或遺傳規律復雜、致病基因譜巨大的突變基因篩查工作時，往往無法在短時間內得到有效、精確、科學的實驗結果。隨著科學技術的進步，第二代DNA測序技術，又被稱為高通量測序技術，以低成本、高準確度、高通量等優勢成為先天性基因突變篩查的主流技術，特別適用于致病基因譜龐大、遺傳規律復雜的先天性遺傳病的致病基因突變篩查。

目前，DNA分子測序技術又迎來了第三代，發明人是Stephen W Turner博士和Jonas Korlach博士。測序技術經過前面的發展，單次測序讀取長度從Sanger測序時代的1000bp，降到了高通量測序時代的幾百bp，到了三代測序技術又擁有了超長的讀取長度，通量和速度都得到了大幅提升。它彌補了前兩代測序技術中諸多缺點，如讀長短、受目標片段GC含量影響大等局限。三代測序最大的優勢點是可以進行單分子測序，即實驗者在測序過程無需對測序目標片段進行PCR擴增。第三代基因測序最大讀取長度得到了有效增加，可以大大減少拼接成本，從而節省試劑消耗和操作步驟。由于該測序技術無需PCR擴增目標片段，因此避免了由于反復大量的DNA復制引入的堿基復制錯誤，造成假陽性實驗結果。第三代測序技術還可拓展應用于甲基化DNA序列測序、RNA序列測序以及其他微量樣本測序等。第三代測序技術的一個亮點在于甲基化DNA序列測序。測序過程中DNA聚合酶復制四種堿基的速度是不一樣的，正常的堿基或者發生甲基化的堿基為模板，DNA聚合酶停頓的時間也是不同的。系統根據時間的不同，可以判斷模板的堿基是否甲基化。三代測序缺陷也具有一定缺陷，如單讀長的錯誤率偏高、為糾錯發生的重復測序增加了不必要的測序成本、對DNA聚合酶的活性有嚴格要求以及整體實驗成本較高等。

隨著分子生物技術的不斷發展，我們相信層出不窮的DNA測序技術會實現更簡便的實驗操作，達到更精確、更快捷的實驗結果，會成為遺傳病致病基因突變篩查的有力工具。

4 結論

本研究通過對一個先天性核型白內障核心家系DNA樣本進行高通量測序聯合Sanger測序,發現CRYAB c.59C>G，p.P20R為該家系的致病突變。CRYAB基因雜合錯義突變可導致先天性核型白內障的發生。