蘇云金芽孢桿菌對黏蟲致病力及生長發育的影響

于洪春，王 煜，孫苓芙，莊寶龍，李松媛，張蒙皓，侯月敏

（1.東北農業大學農學院，哈爾濱 150030；2.沂水縣農業農村局，山東 沂水 276400）

黏 蟲[Mythimna separata(Walker)]，屬 鱗 翅目、夜蛾科，為害水稻、玉米、小麥等多種植物[1-2]，具有遷飛能力強、發生范圍廣、暴食性突出、間歇性爆發、經濟損失嚴重等特點[3-4]，是我國危害較重的糧食作物害蟲。黏蟲作為突發性和爆發性害蟲可造成巨大經濟損失，威脅糧食生產安全[5-7]。

目前，殺蟲燈和糖醋液誘殺成蟲的綠色防控措施[2]等均為輔助防治措施，黏蟲防治仍以化學藥劑防治為主[8]。由于化學殺蟲劑連續使用，黏蟲對擬除蟲菊酯類等化學殺蟲劑已產生較嚴重抗藥性[9]，防效降低。且施藥次數和用藥量增多，增加防治成本，造成環境污染和食品安全性降低。因此，綠色防控技術成為黏蟲防治研究熱點。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）對靶標生物具有殺蟲特異性，已應用于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等害蟲生物防治[10-11]。在利用Bt防治黏蟲領域，昆蟲病原線蟲與Bt聯用可提高對黏蟲防效[1]，表達Cry1Ab殺蟲蛋白的轉Bt玉米對黏蟲幼蟲有較好控制效果[12-13]。對黏蟲有殺蟲活性的Bt蛋白篩選研究也有報道[14]，但有關Bt菌株對黏蟲致病力研究較少。因Bt菌株異質性，不同菌株對同一寄主昆蟲致病性存在較大差異，因此，搜集、篩選和分離高致病力菌株是開展Bt防治黏蟲應用基礎性工作。

本研究在64株Bt菌株對黏蟲幼蟲殺蟲活性前期試驗基礎上，篩選出活性較高的9株Bt菌株，采用生物測定方法，篩選出高致病力Bt菌株，明確其對黏蟲不同蟲齡幼蟲及成蟲致病性和致病力；測定Bt致死中濃度處理的黏蟲幼蟲、成蟲生物學指標，探究其對存活蟲體生長發育影響，為開展Bt防治黏蟲提供理論和試驗證據，對黏蟲綠色防控、化學農藥減量和食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲源

試驗用蟲為哈爾濱市郊區黑光燈誘集的黏蟲成蟲，帶回實驗室飼喂5%蜂蜜水后收集卵塊，在人工氣候箱內用新鮮玉米苗飼養幼蟲，根據試驗所需選取不同蟲齡幼蟲及成蟲。

1.1.2 供試菌株

試 驗 所 用Bt5、Bt7、Bt25、Bt30、Bt45、Bt46、Bt61、Bt66和Bt79共9株菌株，為前期試驗篩選的對黏蟲有殺蟲活性的Bt菌株，均由東北農業大學農學院植物保護系農業昆蟲與害蟲防治研究室提供。

1.1.3 培養基

LB固體培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，5%氫氧化鈉調節pH 7.4~7.6。

1.2 方法

1.2.1 高致病力菌株篩選

將預試驗篩選出殺蟲活性較高的上述9株Bt菌株接種到LB固體斜面培養基，28℃條件下培養48 h后用無菌水洗下制成菌懸液并用血球計數板計數。按10倍稀釋法，稀釋至1×109、1×108、1×107、1×106和1×105芽孢·mL-15個濃度，采用浸漬法處理新鮮玉米葉片。每處理接入2齡幼蟲25頭并飼喂帶菌葉片，設置清水對照，3次重復。處理后在溫度（25±1）℃、相對濕度（75±10）%、光周期L14：D10人工氣候箱中飼養。每24 h調查并記錄死蟲數，重新更換新鮮葉片，連續觀察記錄至144 h。計算試蟲死亡率和校正死亡率，求得各菌株第6天毒力回歸方程和LC50，篩選出致病力最高菌株。

1.2.2 Bt菌株對不同蟲齡幼蟲致病力

將1.2.1篩選出致病力最高Bt菌株于28℃培養48 h后，用無菌水洗下。菌液稀釋至1×108、1×107、1×106、1×105和1×104芽孢·mL-15個濃度，浸漬法處理玉米葉片后飼喂1齡幼蟲；1×109、1×108、1×107、1×106和1×105芽孢·mL-15個濃度處理玉米葉片后飼喂2齡、3齡幼蟲；1×1010、1×109、1×108、1×107和1×106芽孢·mL-15個濃度處理玉米葉片后飼喂4齡幼蟲。調查和統計方法同1.2.1，計算求得不同蟲齡下菌株毒力回歸方程和LC50。

1.2.3 Bt菌株對成蟲的致病力

將1.2.1篩選出高毒力Bt菌株配制成1×1010、1×109、1×108、1×107和1×106芽孢·mL-15個濃度菌懸液，然后分別加入蜂蜜制成5%蜂蜜水菌懸液。在每個透明塑料杯（容積300 mL）中接入一對24 h內羽化的雌雄成蟲，用脫脂棉浸蘸蜂蜜水菌懸液置于杯底瓶蓋上，杯口罩紗布用橡皮筋箍緊，每處理5對成蟲，以無菌5%蜂蜜水作對照，3次重復。每24 h調查并記錄死蟲數，并重新更換新鮮浸蘸無菌5%蜂蜜水的棉花團，連續觀察至168 h。計算成蟲死亡率和校正死亡率，以及菌株第7天對成蟲毒力回歸方程和LC50。

1.2.4 Bt菌株致死中濃度處理幼蟲對存活黏蟲生長發育的影響

根據1.2.2試驗結果，篩選出高毒力Bt菌株配制成LC50菌懸液，浸漬法處理玉米嫩葉，以清水作對照，飼喂3齡初幼蟲，每24 h記錄死蟲數并更換新鮮葉片，直至幼蟲全部化蛹。記錄幼蟲發育歷期、蛹重、蛹期、羽化率、性比。羽化后成蟲隨機配對接入塑料杯并在杯底放置浸蘸無菌5%蜂蜜水的棉花團，觀察成蟲習性，記錄成蟲壽命及產卵量。隨機選取不同處理新產含70~100卵粒的卵塊各10塊，記錄卵期及孵化率，孵化出的幼蟲飼養至2齡初，記錄1齡幼蟲死亡率。

1.2.5 Bt菌株致死中濃度處理成蟲對存活黏蟲生長發育的影響

根據1.2.3試驗結果，配制LC50菌液，以1.2.3方法處理成蟲，設無菌5%蜂蜜水作對照，每處理7對成蟲，3次重復。每24 h觀測成蟲死蟲數、行為狀態及產卵情況，記錄每頭成蟲壽命及產卵量。后代生命力觀察和測定指標同1.2.4。

1.2.6 數據處理與分析

采用DPS（V7.05）軟件處理分析生物測定數據，計算各處理組毒力回歸方程、相關系數和致死中濃度。用T檢驗分析致死中濃度下處理組與對照組間各項指標差異顯著性。死亡率（%）=（處理前活蟲數-處理后活蟲數）/處理前活蟲數×100；校正死亡率（%）=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（100-對照組死亡率）×100。

2 結果與分析

2.1 高致病力菌株篩選

9株Bt菌株對黏蟲2齡幼蟲毒力測定結果見表1。同一濃度下幼蟲校正死亡率隨時間增加而升高，同一菌株幼蟲校正死亡率隨菌液濃度升高而增加。各菌株低濃度對幼蟲致病力較差，在1×106和1×105芽孢·mL-1處理144 h后校正死亡率不超過17.81%，而在1×109芽孢·mL-1處理144 h后除菌株Bt30、Bt45外，其余菌株校正死亡率均達98.63%以上；Bt46、Bt61和Bt79在次高濃度1×108芽孢·mL-1處理144 h后幼蟲校正死亡率達91.78%以上。

表1 9株Bt菌株對黏蟲2齡幼蟲毒力測定Table 1 Toxicity of nine Bt strains to 2nd instar larvae of Mythimna separata

9株Bt菌株對黏蟲2齡幼蟲第6天毒力回歸方程及致死中濃度（LC50）見表2。菌株Bt30和Bt45的LC50>2.69×1010芽孢·mL-1，對黏蟲2齡幼蟲致病力較差；Bt46、Bt61和Bt79的LC50小于8.71×106芽孢·mL-1，對黏蟲2齡幼蟲有較高致病力。其中，菌株Bt46在濃度1×109和1×108芽孢·mL-1處理2齡幼蟲24 h后校正死亡率均超81.08%，96 h后兩處理組校正死亡率已達100%，殺蟲速度快、致病力高，為本研究篩選出的高毒力Bt菌株。

表2 9株Bt菌株對黏蟲2齡幼蟲第6天毒力回歸方程及致死中濃度Table 2 Virulence regression equation and median lethal concentration of nine Bt strains to 2nd instar larvae on the 6th day

2.2 菌株Bt46對黏蟲不同蟲齡幼蟲致病力

菌株Bt46對黏蟲不同蟲齡幼蟲致病力見表3。各處理組幼蟲校正死亡率均隨時間增加而升高，但菌株Bt46對不同蟲齡幼蟲致病力存在較大差異。該菌株在試驗所設定濃度下處理1齡幼蟲致病力均較差，144 h后5個濃度校正死亡率為12.00%~37.33%。Bt46在濃度1×109芽孢·mL-1處理144 h時，2~4齡幼蟲校正死亡率分別為100%、92.00%和28.00%；1×108芽孢·mL-1處理144 h時，2~4齡幼蟲校正死亡率分別為100%、24.00%和5.33%，低于1×106芽孢·mL-1濃度對幼蟲幾乎無殺蟲活性。相同處理時間下，除1齡幼蟲外，校正死亡率均隨蟲齡增加而降低，當菌液濃度低于某一閾值其致病力驟減。

表3 菌株Bt46對黏蟲不同蟲齡幼蟲致病力Table 3 Pathogenicity of the No.46 Bt strain against larvae of different instars

通過DPS（V7.05）軟件分析與計算，Bt46處理1~4齡幼蟲144 h后毒力回歸方程、相關系數及致死中濃度LC50分別為：Y=0.932X+18.942（R=0.1625），2.09×1018芽孢·mL-1；Y=26.988X-131.38（R=0.9351），5.25×106芽孢·mL-1；Y=18.267X-99.337（R=0.8004），1.51×108芽孢·mL-1；Y=22.267X-150.67（R=0.8386），1.02×109芽孢·mL-1。菌株Bt46對黏蟲2齡幼蟲致病力最強，其次為3齡、4齡幼蟲，而對1齡幼蟲致病力最弱。因此確定菌株Bt46防治黏蟲幼蟲最佳時期為2齡幼蟲期。

2.3 菌株Bt46對黏蟲成蟲致病力

菌株Bt46對黏蟲成蟲生物測定結果見表4。飼喂成蟲菌液后，成蟲校正死亡率隨時間增加而升高，1×1010芽孢·mL-1處理成蟲48~168 h校正死亡率由33.33%升至80.77%。同時校正死亡率隨菌液濃度降低而降低，高濃度菌液對成蟲致病力較強，當菌液濃度為1×108芽孢·mL-1及以下時成蟲校正死亡率低于30.77%，低濃度菌液對成蟲致病力較差。Bt46處理成蟲第7天毒力回歸方程為Y=-0.2950+0.6109X（R=0.9840），致死中濃度（LC50）為4.66×108芽孢·mL-1。觀察存活成蟲產卵發現，當菌液濃度>1×108芽孢·mL-1時，大部分雌成蟲不產卵，產卵時間較未飼喂菌液的對照延后10~48 h，單雌產卵量顯著降低，半數以上卵無法孵化幼蟲。

表4 菌株Bt46對黏蟲成蟲的生物測定Table 4 Bioassay of No.46 Bt strain to adults

2.4 菌株Bt46半致死濃度處理幼蟲對存活蟲體生長發育的影響

菌株Bt46半致死濃度處理黏蟲3齡初幼蟲后存活群體及其后代各生物學指標見表5。經Bt46處理后，存活幼蟲發育歷期延長1.1 d、化蛹率降低7.2%、蛹期縮短0.23 d、蛹重增加0.03 g、羽化率降低2.4%、性比（雌：雄）降低0.21%、雄蟲壽命延長1.85 d、雌蟲壽命延長1.21 d、產卵量減少255粒·雌-1，但與對照組差異均不顯著（P>0.05）。處理組后代卵期延長0.40 d，孵化率降低48.20%，與對照組差異顯著（P＜0.05）；后代1齡幼蟲死亡率達13.82%，為對照組死亡率2倍以上，但與對照組差異不顯著（P>0.05）。

表5 菌株Bt46半致死濃度處理3齡幼蟲后生物學參數Table 5 Biological parameters of No.46 Bt strain median lethal concentration on 3rd instar larvae and offspring

2.5 菌株Bt46半致死濃度處理成蟲對存活蟲體生長發育的影響

菌株Bt46半致死濃度處理黏蟲成蟲后存活群體及其后代的生物學參數見表6。與無飼喂菌液對照相比，處理組雌蟲與雄蟲平均壽命分別縮短4.76和14.67 d，單雌平均產卵量降低960.8粒，后代1齡幼蟲死亡率增加15.68%，與對照組均達極顯著差異（P＜0.01）。處理組卵期與對照相比差異不顯著。雖然處理組孵化率低于對照組12.10%，但二者差異不顯著。飼喂菌株Bt46菌液后，雌蟲比雄蟲壽命更短，產卵過后即死亡，平均壽命不足4 d，產卵量約為對照組產卵量的1/3。研究結果表明，菌株Bt46半致死濃度飼喂成蟲，對成蟲及其后代生命力均有不利影響。

表6 菌株Bt46半致死濃度處理成蟲后生物學參數Table 6 Biological parameters of No.46 Bt strain median lethal concentration on adults and offspring

3 討論與結論

蘇云金桿菌殺蟲活性蛋白不同，其對同種害蟲毒力存在較大差異[15-16]。一般認為Bt殺蟲晶體蛋白對小地老虎、甘藍夜蛾、黏蟲等夜蛾科害蟲不敏感[15]，導致防治效果不理想。本研究在前期選用高濃度對64株Bt菌株初篩基礎上，發現9株菌株對黏蟲2齡幼蟲有較好殺蟲活性，從中篩選出毒力最強菌株Bt46，其致死中濃度LC50為5.25×106芽孢·mL-1，在1×108芽孢·mL-1濃度2齡幼蟲24 h校正死亡率即達81.08%，96 h達到100%。說明通過擴大Bt菌株篩選范圍，可能獲得對夜蛾科害蟲致病力較強菌株。但濃度低于1×107芽孢·mL-1，菌株Bt46對黏蟲殺蟲活性急劇降低，其致病力明顯依賴于芽孢濃度。

菌株Bt46對黏蟲不同蟲齡致病力研究中發現，其對黏蟲2齡幼蟲殺蟲活性最高，對3~4齡幼蟲殺蟲活性明顯降低，致病力隨蟲齡升高而降低，這與沙槎云等認為黏蟲幼蟲對Bt敏感性隨蟲齡增加而降低的結論一致[17]。但本研究發現菌株Bt46對黏蟲1齡幼蟲致病力較差，遠低于對4齡幼蟲致病力，即使用高濃度菌液，其校正死亡率也未超過40%。原因為黏蟲1齡幼蟲取食量極低，試驗24 h后更換無菌飼料，幼蟲取食菌量較少。因此，在生產實踐中用蘇云金芽孢桿菌制劑防治黏蟲適宜蟲齡期為2齡幼蟲。

本試驗將Bt菌株用于黏蟲成蟲致病性和致病力測定。菌株Bt46在109~1010芽孢·mL-1濃度處理成蟲168 h后校正死亡率達53.85%~80.77%，表明其對成蟲有致病性和一定致病力，同時未死成蟲活躍度降低，部分成蟲無法正常飛行，不足半數成蟲產卵，產卵時間延后，產卵量少且卵大部分無法孵化。因此，根據黏蟲趨化性，在糖醋酒液中添加蘇云金芽孢桿菌可有效誘殺黏蟲成蟲。

近年來，害蟲亞致死效應研究漸多，包括對天敵的影響[18-19]及對靶標生物生長繁殖的影響[20-21]。本文研究菌株Bt46半致死濃度對黏蟲當代幼蟲、成蟲及后代1齡幼蟲的影響。研究發現，菌株Bt46處理幼蟲雖對當代存活幼蟲生長發育無明顯影響，但當代成蟲產卵量降低，后代幼蟲孵化率明顯降低；處理成蟲后，其壽命、產卵量均顯著降低，成蟲飛行活動異常，后代1齡幼蟲行動遲緩，存活率不足80%，表明菌株Bt46半致死濃度對黏蟲生長發育產生不利影響，尤其對黏蟲繁殖力和后代孵化率、存活率影響較大，與化學農藥亞致死濃度處理當代種群導致其繁殖力降低結論一致[22-23]。

本文篩選出對黏蟲致病力較強Bt菌株，明確對黏蟲不同蟲齡和成蟲致病力差異，以及半致死劑量對黏蟲存活群體生長發育可產生不利影響，研究結果對豐富黏蟲綠色防控技術手段，減少化學農藥使用量，延緩黏蟲產生抗藥性和綠色食品生產具有重要意義和實踐價值。