轉TaDREB3a大豆品系KD1遺傳穩定性分析及抗旱性鑒定

孟凡立,李明月，洪志鵬，趙洋，王子葉，馮廣慧，王旋，孔丹珣，王莞迪，張玲

（1.東北農業大學農學院，哈爾濱 150030;2.吉林省農業科學院/吉林省農業生物技術重點實驗室，長春 130033）

大豆是重要的糧食和油料作物，也是人類主要食用蛋白和工業原料來源，在人類日常飲食結構中占有重要比例，大豆生產對提高人類營養水平和促進國民經濟發展具有重要意義[1]。東北作為我國大豆主要種植區，干旱天氣頻繁發生，嚴重影響大豆產量。為解決干旱造成的減產及經濟損失，需培育抗旱大豆品種，擴大干旱地區大豆種植面積，提高大豆單產和總產量。

在干旱脅迫下植物體內代謝發生改變，同時激活相關轉錄因子調節干旱信號傳遞或調控下游抗旱基因表達，可降低不利條件對植物造成的傷害。研究表明，植物體內包含大量轉錄因子，應激反應基因表達涉及不同轉錄調控途徑，順式作用元件和反式作用因子參與并控制各種生物過程動態基因網絡轉錄調控[2]。DREB（Dehydration responsive element binding）類轉錄因子成為近年來植物抗逆境研究熱點后廣受關注，取得突破性進展。

DREB轉錄因子調節應激反應基因表達，在植物非生物脅迫反應中發揮重要作用[3-4]。DREB基因參與的調控網絡十分復雜，針對不同逆境脅迫有不同DREB成員參與，不同來源DREB轉基因植物在逆境脅迫下差異表達的基因也不同[5-6]。DREB轉錄因子通過與抗逆基因啟動子區域中DRE/CRT（脫水反應元件）順式元件結合，調節一系列下游基因（包含DRE/CRT元件），增強植物對不同非生物脅迫抗性[7-8]。在擬南芥中，DREB1A，DREB1B和DREB1C由低 溫 誘導，DREB2A和DREB2B由干旱、高鹽和高溫脅迫等誘導[9-10]。在陸地棉上，發現DREB基 因GhDBP3、GhDBP1和GhDBP2參 與ABA脫水反應途徑[11]。也有一些DREB基因可同時響應低溫、干旱和高鹽等脅迫，例如，甘薯纖維根中SwDREB1基因對干旱、低溫、高鹽等各種脅迫響應[12]。因此，過表達DREB轉錄因子可顯著提高植物非生物脅迫耐受性。迄今為止，關于DREB基因報道和評論主要集中在DREB基因功能驗證，以及在非生物脅迫下各種轉基因植物DREB基因調控機制的鑒定。TaDREB3A在干旱、高鹽、高溫、低溫、病原菌、ABA、乙烯、JA、SA誘導下表達，可特異調控含有DRE/CRT順式元件（核心序列：CC?GAC）基因轉錄表達，提高植物抗旱性、耐鹽性、耐高溫性以及對白粉病病原菌抗性[13]。李冬梅等研究表明，TaDREB3a過表達可改善干旱條件下轉基因大豆生長狀況[14]。Moon等驗證OsDREB1G是水稻中一種新型耐冷脅迫響應DREB基因，其過表達提高水稻耐冷性[15]。柳娜等研究表明將DREB1A轉入小麥品種隴春30顯著增強其抗旱性[16]。

利用基因工程技術培育大豆新品種，可實現大豆抗旱高產栽培。本研究將TaDREB3a基因在大豆中表達后獲得轉基因植株KD1，分析獲得轉基因大豆株系中目的基因TaDREB3a和標記基因bar遺傳穩定性、轉錄和翻譯，以明確轉基因株系遺傳穩定性和分子特征；從轉基因大豆基因型、耐旱表型和農藝性狀等方面研究大豆抗旱性，進一步確定TaDREB3a基因與植物抗旱關系。研究結果有助于闡明TaDREB3a基因在大豆抗旱中作用，為大豆抗旱分子育種提供新的靶基因。為培育抗旱且環境安全轉基因大豆品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

轉基因大豆株系KD1，受體對照墾農18。大豆受體墾農18種子由東北農業大學大豆所保存。

1.2 TaDREB3a基因過表達載體構建及大豆遺傳轉化

從小麥cDNA文庫中篩選到一個長度1 125 bp的TaDREB3a（GenBank登錄號:AY781149.1）cDNA克隆，根據開放閱讀框設計引物（見表1），利用RNA提取試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）提取黑龍江省主栽大豆品種墾農18葉片RNA，反轉錄cDNA為模板，利用KOD高保真酶（TOYOBO）作PCR擴增并對其測序。利用NcoⅠ和BstEⅡ對pCAMBIA3301載體雙酶切，然后將TaDREB3a基因片段連接到pCAMBIA3301載體NcoⅠ和BstEⅡ位點，pCAMBIA3301載體本身攜帶抗除草劑（BASTA）基因bar。

根據Paz等大豆子葉節遺傳轉化方法[17]，將大豆品種墾農18用于農桿菌LBA4404介導遺傳轉化，然后將再生植株移植到28℃/24℃溫室中，光/暗周期調整為16 h/8 h，直至成熟。對13 000個大豆子葉節轉化，經萌發、共培養、不定芽誘導、不定芽伸長和生根等轉化過程，獲得25株再生植株，其中13株開花并結實，6個轉基因株系試紙條檢測為陽性，將6個轉基因株系T0代種子播種在溫室中，利用bar試紙條檢測T1代植株，在KD-1、KD-3、KD-9株系T1代中檢出陽性株系。KD-1 T1代轉基因陽性植株共收獲203粒種子，將種子量較多KD1株系用于后續遺傳分析。

1.3 轉基因大豆植株KD1分子檢測

1.3.1 轉基因大豆植株KD1的PCR檢測

對TaDREB3a和bar基因作PCR檢測，使用Edwards等開發DNA提取方法[18]，從轉基因植株嫩葉中提取總基因組DNA。根據TaDREB3a和bar基因序列設計引物（見表1），擴增產物長度分別為243和238 bp。PCR擴增使用2X Taq PCR Master?Mix（天根有限公司），具體方法參見說明書。T2~T4代KD1轉基因植株均采用上述方法檢測。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.2 轉基因大豆植株KD1轉錄水平表達分析

在東北農業大學轉基因基地種植轉基因大豆KD1的T2~T4代材料，選取鼓粒期（R6期）大豆根、葉、莖和籽粒，液氮速凍后保存。總RNA提取采用Trizol法提取（Invitrogen），提取總RNA經電泳檢測RNA質量及測定濃度后，于-80℃保存。反轉錄反應使用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser（TaKaRa），cDNA樣品用于qRT-PCR分析。

1.4 轉基因大豆植株KD1蛋白水平表達分析

利用南京金絲瑞公司制備TaDREB3a蛋白多克隆抗體對轉基因大豆材料KD1的T2~T4代葉片組織總蛋白作Western blot檢測。采用8%SDS-PAGE分離樣品總蛋白（包括轉基因和受體材料）。分離后蛋白經電轉后轉移至PVDF膜。然后利用脫脂牛奶對膜上非特異性位點封閉。一抗為鼠抗TaDREB3a蛋白抗血清或鼠抗bar-PAT蛋白單克隆抗體，抗體稀釋至終濃度2.0 μg·mL-1；二抗為辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠抗體，稀釋濃度隨一抗稀釋濃度成倍遞增或遞減。經蛋白雜交和洗膜后，使用化學發光的蛋白質印跡試劑盒中A、B液（1：1）在膜上直接顯色，利用化學發光成像系統開展分析。

1.5 轉基因大豆KD1抗旱性鑒定

1.5.1 芽期抗旱性鑒定

將192 g聚乙二醇-6000（PEG-6000）溶解于去離子水中并定容至1 000 mL，配成0.5 MPa的PEG-6000高滲溶液。T3和T4代轉基因大豆KD1和受體墾農18種子用蒸餾水清洗1 min，0.1%氯化汞溶液浸泡1 min，然后用70%乙醇浸泡1 min，蒸餾水沖洗3遍后，將種子放到濾紙上吸干。每個處理3次重復，每個重復含種子30粒。將脅迫處理種子置于放有兩層濾紙培養皿（d=15 cm）中，每皿加入10 mL 0.5 MPa PEG-6000高滲溶液，每隔1 d以稱重法補充蒸餾水以維持溶液滲透勢恒定。將對照處理種子置于放有兩層濾紙的培養皿（d=15 cm）中，每皿加入10 mL蒸餾水，每隔1 d以稱重法補充蒸餾水以維持溶液滲透勢恒定。將脅迫和對照處理的培養皿放入培養箱中，（25±0.5）℃無光條件下培養，每隔2 d更換濾紙1次，第8天調查發芽種子數。

1.5.2 全生育期抗旱性鑒定

T4代轉基因大豆KD1和受體大豆墾農18全生育期抗旱性鑒定在旱棚和田間條件下完成。參考北京市地方標準DB11/T 720-2010（大豆品種抗旱性鑒定方法及評價）[19]，大豆種植密度為1萬~1.2萬株·hm-2，試驗設干旱和對照兩個處理，隨機區組排列，3次重復，3行區，行長3 m，行距0.55 m；在旱棚內播種前土壤田間持水量控制在（80±5）%，播種后在第3個三出復葉完全展開時期（V3期）人工補水一次，之后試驗地不再人工補水。在旱棚外鄰近試驗地設置對照試驗，田間條件下，對照試驗土壤狀況與旱棚一致且僅接受自然降水，保證大豆全生育期處于水分適宜狀態，其他管理與脅迫處理一致。每個小區測定10個單株株高、主莖節數、單株莢數、單株粒數、單株粒重和單株生物量。

1.6 轉基因大豆KD1對靶標和非靶標除草劑抗性及耐性鑒定

1.6.1 轉基因大豆KD1對除草劑BASTA抗性穩定性鑒定

在東北農業大學轉基因基地種植T2~T4轉基因大豆KD1和受體墾農18，對靶標除草劑BASTA（主要成分為草丁膦）耐性鑒定于田間完成，轉基因大豆幼苗三出復葉時噴施靶標除草劑BASTA（濃度分別為1 000、2 000、4 000 mg·L-1）。2和4周后調查轉基因大豆耐除草劑情況，計算受害率。受害率（%）=Σ（N×S/T×M）×100；式中，X-受害率（%），N-同級受害株數，S-級別數，T-總株數，M-最高級別。除草劑藥害癥狀標準見表2。

表2 除草劑藥害癥狀分級標準Table 2 Grading standards of herbal medicine injury symptoms

1.6.2 轉基因大豆KD1對非靶標除草劑抗性及耐性鑒定

在田間鑒定轉基因大豆KD1對非靶標除草劑耐受性。以受體大豆墾農18為對照。在東北農業大學轉基因基地播種行長1 m，播種深度約3 cm，每行播種17粒，播種后按常規栽培方式管理。選用田間常用非靶標除草劑草甘膦、烯禾啶，按照推薦使用劑量1 000、2 000、4 000 mg·L-1濃度噴施，設清水為對照，3個重復。

噴施2和4周后調查和記錄成苗率、植株高度（選取最高5株）、藥害癥狀（選取藥害癥狀最輕5株），計算受害率，利用新復極差法比較轉基因、受體和普通栽培大豆對常規非靶標除草劑耐受性差異。

2 結果與分析

2.1 轉基因大豆植株KD1的PCR檢測分析

為檢測轉基因大豆植株，對連續3代（T2~T4代）轉基因大豆KD1不同單株作PCR檢測，以含目的基因TaDREB3a質粒為陽性對照，以非轉化植株墾農18和水為陰性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。PCR結果如圖1所示，均可檢測到目的基因TaDREB3a片段，擴增片段長度為243 bp（見圖1），結果表明外源基因在轉基因大豆KD1后代中穩定遺傳。對連續3代（T2~T4代）轉基因大豆KD1不同單株中bar基因作PCR檢測，擴增片段長度為238 bp（見圖2），結果表明外源基因TaDREB3a和標記基因bar在轉基因大豆KD1后代中穩定遺傳。

圖1 轉基因大豆TaDREB3a基因PCR檢測Fig.1 PCR detection of TaDREB3a gene in transgenic soybean

圖2 轉基因大豆bar基因PCR檢測Fig.2 PCR detection of bar gene of transgenic soybean

2.2 轉基因大豆植株KD1轉錄水平表達分析

為檢測整合到基因組上目的基因TaDREB3a和標記基因bar在轉基因大豆株系KD1中表達情況，以及在根、莖、葉、籽粒中各組織表達量差異情況，提取KD1植株鼓粒期（R6期）根、莖、葉、籽粒總RNA，利用qRT-PCR分析轉基因大豆KD1 T2~T4代植株根、莖、葉、籽粒中TaDREB3a表達水平。結果表明，目的基因TaDREB3a在轉基因大豆KD1不同組織中均表達，在葉片中表達量相對較高，籽粒中表達量相對較低，TaDREB3a基因在葉片中表達量為籽粒3倍。連續三代不同組織中TaDREB3a基因表達水平分析結果也表明，TaDREB3a基因在各世代不同組織中穩定表達（見圖3）。

圖3 轉基因大豆KD1 T2~T4代鼓粒期不同組織部位TaDREB3a基因表達水平Fig.3 TaDREB3a gene expression levels in different tissues of transgenic soybean KD1 T2-T4 at the seed filling period

利用qRT-PCR分析轉基因大豆KD1 T2～T4代植株根、莖、葉、籽粒中bar基因表達水平，分析結果表明，標記基因bar在轉基因大豆KD1不同組織中均表達，在根和葉片中表達量相對較高，bar基因在葉片中表達量是籽粒3倍，在根中表達量是籽粒2倍。連續三代不同組織bar基因表達水平分析結果也表明，bar基因在各世代不同組織中穩定表達（見圖4）。

圖4 轉基因大豆KD1 T2~T4代鼓粒期不同組織部位bar基因表達水平Fig.4 bar gene expression levels in different tissues of transgenic soybean KD1 T2-T4 generation at the seed filling period

2.3 轉基因株系KD1中TaDREB3a和bar蛋白表達分析

2.3.1 TaDREB3a蛋白表達量分析

Western blot檢測結果表明，外源蛋白TaDREB3a在轉基因大豆KD1中獲得表達，約為43 ku，與預期一致。在轉基因材料KD1不同世代（T2~T4）中均檢測到TaDREB3a蛋白（見圖5），表明外源TaDREB3a蛋白在轉基因材料后代中穩定表達并遺傳。

圖5 轉基因大豆TaDREB3a蛋白檢測Fig.5 Detection of TaDREB3a protein in transgenic soybeans

2.3.2 bar蛋白表達量分析

為進一步分析轉化的標記基因bar是否翻譯成蛋白質，對轉基因大豆材料KD1的T2~T4代葉片組織總蛋白作Western blot檢測。結果表明，在轉基因材料KD1不同世代（T2~T4）葉片組織中均檢測到21 ku蛋白條帶，與預期一致，而受體墾農18未檢測到21 ku蛋白條帶（見圖6），說明bar蛋白可在轉基因材料后代中穩定表達。

圖6 轉基因大豆KD1 bar蛋白Western blot檢測Fig.6 Western blot detection of KD1 bar protein in transgenic soybeans

2.4 轉基因大豆KD1抗旱性鑒定

2.4.1 芽期抗旱性鑒定

對T3和T4代轉基因大豆作芽期抗旱性鑒定，利用0.5 MPa PEG-6000高滲溶液處理7 d后，轉基因材料KD1種子萌發較好，其相對發芽率為88%~90%，受體大豆墾農18相對發芽率為10%，轉基因材料KD1發芽率顯著高于對照受體材料（見圖7），連續2代芽期抗旱性鑒定結果表明，T3和T4代KD1芽期抗旱性均為較耐，且芽期抗旱性狀穩定遺傳。

圖7 T3~T4代轉基因大豆KD1芽期抗旱性鑒定Fig.7 T3-T4 generation transgenic soybean KD1 drought resistance identification at the bud stage

2.4.2 全生育期抗旱性鑒定

在東北農業大學轉基因實驗基地抗旱棚內對轉基因大豆KD1和對照墾農18開展田間抗旱脅迫處理，觀察轉基因大豆與受體之間生長情況。在田間僅接受自然降水狀態下，T4代轉基因大豆KD1和受體大豆墾農18株高、節數、單株莢數、每株粒數以及百粒重均無顯著差異（見表3）；在干旱脅迫下，轉基因大豆和受體大豆株高、節數、單株莢數、單株粒數明顯減少，兩者間存在顯著差異，轉基因大豆株高、單株莢數、單株粒數、百粒重明顯高于受體大豆墾農18（見表3）。

表3 全生育期干旱農藝性狀Table 3 Agronomic traits of drought throughout the growth period

2.5 轉基因大豆KD1對靶標除草劑抗性及耐性鑒定

2.5.1 轉基因大豆KD1對除草劑BASTA抗性穩定性鑒定

對KD1轉基因材料T2~T4代材料在苗期田間噴施除草劑BASTA（1 500 mg·L-1BASTA，主要成分為草丁膦）抗性檢測，田間除草劑抗性篩選結果表明，轉基因材料KD1對除草劑1 500 mg·L-1BASTA具有較好耐受性，而受體品種墾農18葉片則全部黃化壞死（見圖8）。連續3代（T2~T4）田間除草劑抗性篩選結果表明，轉基因大豆KD1對除草劑1 500 mg·L-1BASTA耐受性較好，表明外源基因bar在轉基因大豆中可穩定表達（見圖8）。

圖8 轉基因大豆KD1除草劑（1 500 mg·L-1 BASTA）抗性檢測Fig.8 KD1 herbicide(1 500 mg·L-1 BASTA)resistance test of genetically modified soybean

2.5.2 轉基因大豆KD1對靶標除草劑耐性鑒定

利用1 000、2 000和4 000 mg·L-1BASTA噴施轉基因大豆KD1和受體墾農18葉面。噴施除草劑BASTA 2周后，受體品種墾農18葉片枯黃，其生長發育受嚴重影響。4周后，受體墾農18植株全部死亡。而轉基因大豆KD1在3種濃度BASTA葉面噴灑2和4周后，葉片表型均正常，植株正常生長發育，與清水對照處理相同。上述試驗結果表明，轉基因大豆KD1對1 000、2 000和4 000 mg·L-1BASTA均具有較好耐受性（見表4和圖9）。

圖9 轉基因大豆KD1對靶標除草劑BASTA耐性鑒定（4 000 mg·L-1）Fig.9 Identification of the resistance of transgenic soybean KD1 to the target herbicide BASTA

表4 轉基因大豆KD1對靶標除草劑BASTA耐性鑒定Table 4 Identification of the tolerance of genetically modified soybean KD1 to the target herbicide BASTA

2.6 轉基因大豆KD1對非靶標除草劑耐受性分析

利用滅生性除草劑草甘膦和大豆苗后除草劑烯禾啶分別噴施轉基因大豆KD1和受體墾農18。500、1 000和2 000 mg·L-1草甘膦噴施轉基因大豆KD1和受體墾農18兩周后，轉基因大豆KD1和受體墾農18全部死亡。表明滅生性除草劑草甘膦可全部殺死轉基因大豆KD1和受體墾農18。

利用專殺禾本科雜草的烯禾啶噴施轉基因大豆KD1和受體墾農18四周后，轉基因大豆KD1和受體墾農18受害率為0，且3種濃度烯禾啶對轉基因大豆KD1和受體墾農18株高無顯著影響（見表5和6）。

表5 KD1對草甘膦耐受性鑒定Table 5 KD1 to glyphosate tolerance identification

表6 KD1對烯禾啶耐受性鑒定Table 6 KD1 tolerant identification of enoxydim

3 討論與結論

在全球氣候變化影響下，農作物在生長過程中不可避免面臨許多非生物脅迫因素，對其生長和整體生產力造成嚴重威脅。其中，干旱被認為是嚴重脅迫源，影響作物產量穩定性[20]。現代生物技術打破生物之間界限實現遺傳物質重新組合，按照人類預先設計改造生物，改善大豆抗旱性，提高大豆產量。通過將抗旱基因導入栽培大豆品種，提高大豆抗旱能力，培育出具有高抗旱特性大豆新品種，產生巨大社會和經濟效益。

轉基因育種最終目標是在改良目標性狀前提下，盡量不影響作物其他品質和產量性狀，或提升作物品質和產量性狀。但研究結果表明，表達外源基因改變轉基因作物目標性狀，影響轉基因作物其他性狀。例如，林茹等分析GmMYB12B轉基因大豆株系和非轉基因對照植株農藝性狀[21]，轉GmMYB12B基因大豆除增強抗旱性，受到干旱脅迫后轉基因大豆株系和非轉基因對照植株相比，主根更長側根更多。樊超等將抗旱相關基因GsSA?MS轉入大豆植株與非轉基因對照相比明顯提高其抗旱性，且5個轉基因株系農藝性狀無顯著變化，說明轉GsSAMS基因對農藝性狀未產生影響[22]。

本研究調查T4代轉TaDREB3a基因KD1株系與受體墾農18性狀。對轉基因大豆材料KD1抗旱性分析表明，轉基因材料KD1種子相對發芽率顯著高于對照受體材料。對KD1表型和綜合農藝性狀評價表明，在田間自然狀態下，轉基因大豆KD1和受體大豆墾農18株高、節數、單株莢數、每株粒數以及百粒重均無顯著差異，但在干旱脅迫下，轉基因大豆株高、單株莢數、單株粒數、百粒重明顯高于受體大豆墾農18。用不同濃度靶標及非靶標除草劑噴施轉基因大豆KD1和受體墾農18，4周后轉基因大豆KD1和受體墾農18表型和株高無顯著差異。因此，本研究證明外源基因TaDREB3a和標記基因bar在轉基因大豆KD1葉、莖、根和籽粒中均轉錄和翻譯，TaDREB3a基因在葉片和根中轉錄水平較高，TaDREB3a基因在受體植株墾農18中正常表達可提高目標性狀抗旱性。轉基因大豆KD1對靶標除草劑BASTA抗性良好，對非靶標除草劑草甘膦和烯禾啶耐受性與受體墾農18相比無顯著差異，對株高無影響。TaDREB3a基因在大豆墾農18中表達可提高目標性狀抗旱性，不改變靶標及非靶標除草劑性狀。李冬梅等研究表明轉TaDREB3a基因大豆在復雜的大田干旱條件下主要農藝性狀，包括株高、分支數、節數、莢數、粒數、百粒重及單株粒重均明顯優于對照組大豆東農50[14]，說明干旱條件下，轉TaDREB3a基因可提高受體抗旱性，從而提高作物產量性狀。當肥水多時，耐旱品種是否耐澇應通過相關試驗加以驗證，也需綜合評估DREB轉基因大豆在田間條件下單個或多個脅迫后耐受性和產量潛力，以便進一步大規模栽培DREB轉基因大豆。