胃癌原發灶和區域淋巴結轉移灶中鋅指蛋白139、血管內皮生長因子的表達及臨床意義

薛孝斌，劉剛，任冬莉

西安市長安區醫院普通外科1、腫瘤科2、麻醉科3，陜西 西安 710100

胃癌是目前國內常見的消化道惡性腫瘤，我國胃癌病例每年新增超40 萬，患病率位居癌癥患病率第二，死亡率位居癌癥死亡率第三[1-2]。胃癌臨床進展較快，中晚期多出現區域淋巴結轉移，根治術術后引起胃腸功能倒退常出現乏力、惡心和嘔吐等不良反應，故胃癌預后較差，中晚期多采用保守藥物治療，探索其發病機制，找出影響病情進展主要節點并及時干預對控制胃癌轉移、改善患者預后有重要意義[3-4]。鋅指蛋白(zinc finger protein，ZNF)結構特殊，可與DNA、蛋白質等大分子相結合或ZNF-ZNF 相互結合進而參與基因轉錄的調控[5]。ZNF139屬于ZNF家族，可通過調節基因表達進而參與細胞分化，與腫瘤分化轉移關系密切，研究指出ZNF139能調節食管-胃交界腺癌腫瘤細胞增殖，在癌組織高表達[6]。腫瘤細胞增生對血供需求較高，血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達可促進血管內皮細胞大量增殖、加快血管新生進而促進腫瘤細胞增殖轉移[7]。研究指出VEGF 高表達可介導肺癌腫瘤細胞的生長和轉移，并參與結腸癌患者淋巴管生成并促進淋巴結轉移[8]。因此，ZNF139 和VEGF 表達與腫瘤發生發展密切相關，研究兩者表達與胃癌發生和轉移的關系可為臨床胃癌治療藥物研發提供一定思路。 盡管ZNF139和VEGF表達與胃癌發生相關研究較多，但有關兩者表達與胃癌淋巴結轉移關系研究較少，為此本研究將圍繞這一重點開展研究，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019 年2 月至2020 年8 月間在西安市長安區醫院治療且符合以下納入和排除標準的78例胃癌手術患者，所有患者均經術后病理學檢查為腺癌，其中42例伴區域淋巴結轉移患者均取得相應轉移淋巴結組織。78 例患者中男性44 例，女性34例；年齡38～75歲，平均(57.25±9.26)歲；腫瘤分化程度：低分化30 例、高分化48 例；據美國癌癥聯合會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)對胃癌的TNM分期標準[9]分為Ⅰ～Ⅲ期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期23例，Ⅲ期39例；腫瘤直徑≤5 cm者45例、直徑>5 cm者33例；伴淋巴結轉移者42例。

1.2 納入與排除標準納入標準：患者為初次發病，年齡≥18歲；參照相關指南[10]標準，經病理檢查確診為胃腺癌；均行手術治療且愿意配合術中病理組織留樣；術前無抗腫瘤治療既往史；研究獲患者知悉同意。排除標準：病情危重者；伴其他部位惡性腫瘤者；伴先天性疾病及心、肺、肝、腎等嚴重器質性障礙者；伴嚴重免疫系統疾病者。

1.3 方法

1.3.1 ZNF139、VEGF 檢測將分離組織的石蠟切片切為厚4.0 μm/片的薄片，脫蠟后通過免疫組織化學染色法將標本染色。首先用0.50%高錳酸鉀浸泡水洗5～20 min，再用1.0%草酸浸泡2～5 min實現脫色(通過癌組織大小和鏡下觀察脫色度具體判定)，脫色后對抗原熱修復25 min，將薄片置于3.0% H2O2室溫下孵育12 min，檸檬酸鈉伴高溫促進抗原的修復，隨后冷卻10 min并清洗，使用小牛血封閉液封閉胃癌組織和轉移淋巴結組織20 min后清洗3次，每次2 min。隨后用兔抗人ZNF139單克隆抗體(美國Sigma公司提供)、鼠抗人VEGF 單克隆抗體(上海長島抗體診斷試劑有限公司)；均按說明書配比稀釋，稀釋后在4℃環境下孵化一夜。清洗后37℃環境下孵化二抗半小時。再用鏈霉親和素-生物素復合物免疫組化劑孵育半小時，復溫50 min 后用鏈霉親和素-生物素復合物免疫組化劑孵育0.5 min，二氨基聯苯胺顯色10 min，蘇木素再染色5 min 后清洗、脫水、固定封片即可鏡下觀察。

1.3.2 染色觀察結果判定標準細胞質或細胞核在鏡下可見棕褐色顆粒物為ZNF139 和VEGF 表達陽性表現，其中VEGF主要集中在細胞質，對陽性細胞占比和染色強度進行分級計分，最后綜合判定表達是否是陽性。ZNF139 和VEGF 染色強度評價標準：無色、淡黃、棕黃、棕褐依次對應0 分、1 分、2 分、3 分。ZNF139表達陽性顯色細胞所占比例計分標準：≤15%、15%～55%、55%～75%、>75%依次記為1 分、2 分、3 分、4 分。VEGF 表達陽性顯色細胞所占比例計分標準：<10%、10%～25%、26%～50%、>50%依次記為0 分、1分、2分、3分。ZNF139陽性判定標準：陽性細胞占比和染色強度評分相加為1 分計為陰性，>1 分計為陽性。VEGF 陽性判定標準：陽性細胞占比和染色強度評分相乘，0分為陰性，≥1分為陽性。

1.4 統計學方法應用SPSS18.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，計數資料比較采用χ2檢驗；兩變量不滿足直線相關性分析條件，采用Spesrman 相關性分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌原發灶和區域淋巴結轉移灶中ZNF139和VEGF 表達率比較胃癌區域淋巴結轉移灶ZNF139和VEGF表達率明顯高于其在原發灶表達率，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1，其中ZNF139、VEGF免疫組化染色結果見圖1和圖2。

圖1 ZNF139免疫組化染色(×400)

圖2 VEGF免疫組化染色(×400)

表1 胃癌原發灶和區域淋巴結轉移灶中ZNF139 和VEGF 表達率比較[例(%)]

2.2 胃癌癌組織ZNF139表達與臨床病理特征的關系胃癌癌組織ZNF139 表達率與腫瘤分化度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小無關(P>0.05)，見表2。

表2 胃癌癌組織ZNF139表達與臨床病理特征的關系[n=78,例(%)]

2.3 胃癌癌組織VEGF 表達與臨床病理特征的關系胃癌癌組織VEGF表達率與腫瘤分化度、TNM分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤大小無關(P>0.05)，見表3。

表3 胃癌癌組織VEGF表達與臨床病理特征的關系[例(%)]

2.4 胃癌癌組織ZNF139與VEGF的表達與臨床病理特征的相關性胃癌癌組織ZNF139 與VEGF 的表達水平與腫瘤低分化、TNM 高分期、淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)，見表4。

表4 胃癌癌組織ZNF139與VEGF的表達與臨床病理特征的相關性

3 討論

據統計，胃癌發病率和死亡率在惡性腫瘤中排名中均靠前，嚴重威脅人類生命健康和生活治療[11]。在胃癌發生和進展中，腫瘤細胞發生凋亡抵抗和凋亡調控逃逸，這促進了腫瘤細胞發生惡性增殖、轉移，進而導致腫瘤細胞迅速蔓延[12]。此外，腫瘤局部豐富新生血對腫瘤細胞增殖、脫落和轉移具有促進作用，嚴重影響化療效果。故促進腫瘤細胞凋亡、抑制血管生成對抑制胃癌淋巴結轉移、改善患者預后意義重大[13-14]。既往研究中指出ZNF139 參與腫瘤細胞凋亡調控和增殖信號通路調控、VEGF 抑制劑一直作為惡性腫瘤患者抗血管生成化療方案的主要用藥[15-16]。兩者與胃癌發生關系密切，但有關兩者在胃癌原發灶及淋巴結轉移灶間表達情況差異研究較少，故研究兩者表達情況與淋巴結轉移發生關系對胃癌淋巴結轉移發生患者治療藥物研發有一定啟發。

本研究結果顯示，胃癌患者原發灶中ZNF139、VEGF表達陽性率低于區域淋巴結轉移灶。YAO等[17]在研究中指出ZNF139 與其對應環狀RNA 可參與激活PI3K/AKT信號通路，AKT屬于原癌基因，經過磷酸化激活后可促進腫瘤細胞增殖轉移和分化；李勇等[18]在研究中指出ZNF139可通過促進凋亡抑制蛋白表達來調控腫瘤細胞凋亡通路、抑制腫瘤細胞凋亡，故淋巴結轉移多屬于胃癌進展期，其病變程度較原發灶重，腫瘤細胞增殖分化程度和凋亡逃避能力較高，故ZNF139表達程度高。VEGF促進血管內皮細胞分裂、增殖進而產生豐富新生血管滿足腫瘤細胞營養物質需求、促進腫瘤細胞發生淋巴轉移、增加腫瘤細胞侵襲力[19-20]。故淋巴結轉移灶多出現于胃癌中晚期，局部血管較原發灶豐富，VEGF 表達率較高，與修麗娟等[21]研究結果相似。

本研究結果顯示，胃癌患者原發灶中ZNF139、VEGF表達陽性率與腫瘤分化程度、TNM分期、區域淋巴結轉移呈正相關關系，這與李勇等[18]和王文廉等[22]結果相似，分析其原因可能是ZNF139高表達通過調控細胞凋亡基因Survivin、Bcl-2 來抑制腫瘤細胞凋亡；通過激活原癌基因AKT促進腫瘤細胞增殖轉移，細胞形態與正常細胞差異大，故ZNF139 表達率與胃癌腫瘤低分化、TNM 高分期、淋巴結轉移發生率呈正相關。VEGF 可與相應受體結合激活下游信號通路、靶向作用于血管內皮細胞、破壞血管結構穩定性來促進血管新生進而促進腫瘤細胞增殖分化[23-24]。此外，VEGF種類較多，其中VEGF-C 過表達可促進淋巴管生成進而誘發腫瘤細胞通過淋巴管發生淋巴結轉移，與腫瘤進展關系密切，故VEGF 表達率與胃癌腫瘤低分化、TNM高分期、淋巴結轉移發生呈正相關。

綜上所述，胃癌發生區域淋巴結轉移后ZNF139、VEGF 表達能力增強，兩者表達情況與胃癌病情進展密切相關。