山東一規(guī)模化驢場主要細菌病的流行病學與防控研究

朱曼玲，齊鵬飛，丁召亮，劉文強，程國明，楊宏軍，王長法，張偉

（1.聊城毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，山東 聊城 252000；2.山東省農業(yè)科學院，山東 濟南 250100；3.山東東阿黑毛驢牧業(yè)科技有限公司，山東 聊城 252000；4.東營市畜牧獸醫(yī)站，山東 東營 257091）

山東省規(guī)模化驢場存欄量占全省驢存欄總量的80%左右，其組織化、規(guī)模化程度居全國前列。規(guī)模化養(yǎng)驢比傳統(tǒng)分散養(yǎng)殖在飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)調配、環(huán)境控制等方面均發(fā)生了較大變化，但在疫病防控、綠色生產等方面相對于其它畜禽的養(yǎng)殖水平仍有差距。驢駒腹瀉問題嚴重，導致繁殖率、生產性能下降，嚴重影響了養(yǎng)殖效益。為明晰集約化驢場細菌感染及流行狀況，為規(guī)模化驢場提供科學防控策略，本試驗于2018—2020年對山東一規(guī)模化驢場進行了系統(tǒng)的流行病學調查與研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料 從驢產業(yè)優(yōu)勢聚集區(qū)山東聊城某規(guī)模化驢場采集新鮮的臨床組織病料液氮保存運輸，腸道拭子4℃保存運輸。

1.1.2 主要試劑 5%綿羊鮮血平板、營養(yǎng)肉湯瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、2×TaqPCR Master Mix、ddH2O、EasyPure?Bacteria Genomic DNA Kit，購自北京全式金生物技術有限公司；DL 2000 DNA Marker，購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離培養(yǎng) 將采集的冷藏病料組織置于超凈工作臺中，用接種環(huán)取病料組織內部并接種至5%綿羊鮮血平板培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取優(yōu)勢單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯瓊脂平板培養(yǎng)基中進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 OTUs聚類和物種分類分析 采用CTAB法提取樣品基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，備用。根據(jù)所擴增的16S rDNA區(qū)域特點，構建小片段文庫，基于Illumina NovaSeq測序平臺對該文庫進行雙末端測序。對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)，然后基于有效數(shù)據(jù)進行OTUs聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結果，對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況；同時對OTUs進行豐度計算和花瓣圖等分析［1－3］。

1.2.3 小鼠致病性試驗 將18～22 g的SPF級昆明小鼠隨機分為2組，每組10只，感染組每只注射0.2 mL（1.8×109cfu/mL）大腸桿菌菌懸液，健康對照組每只注射0.2 mL無菌PBS溶液，均采用腹腔注射方式。接種后在相同的環(huán)境下隔離飼養(yǎng)，觀察7 d，記錄臨床癥狀、死亡時間和數(shù)量。

1.2.4 剖檢小鼠與病理組織學觀察 對攻毒后死亡的小鼠剖檢觀察各組織臟器病變。取小鼠的病變臟器，制作石蠟切片，常規(guī)蘇木素－伊紅（HE）染色，光學顯微鏡觀察攻毒后小鼠臟器的病理組織學變化。

1.2.5 疫病防控 針對驢駒出生20天后至斷奶期間出現(xiàn)的腹瀉突出問題，對4個圈舍的345頭驢（駒）連續(xù)2周不間斷進行摸排，將發(fā)病的進行特殊標記編號，并灌服制劑一進行治療。根據(jù)16S rDNA高通量測序結果，另選取出現(xiàn)腹瀉癥狀的驢駒60頭，體重50～60 kg，隨機分為4組，每組15頭。1組:制劑一（短小芽孢桿菌與植物乳桿菌等）加少量水溶解，灌服計量50×108cfu/頭，每天2次；2組:母子安散按照0.1 g/kg飼喂，每天2次；3組:白頭翁散按照0.1 g/kg灌服，每天2次；4組:10%鹽酸環(huán)丙沙星注射液，每10 kg體重肌肉注射1.25 mL，每天1次。治療周期為5天。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離和鑒定

本試驗共分離大腸桿菌12株、志賀氏菌3株、克雷伯菌1株。參照其他物種致病性大腸桿菌毒力因子的檢測標準對驢源大腸桿菌進行分析，發(fā)現(xiàn)其沒有K88、K99、937P和F41等毒力基因，采用MLST分型方法對分離到的菌株進行分型，目前分離到的菌株主要有ST88、ST410和ST11390。

2.2 細菌群落結構

通過對樣品深度測序解析樣本中的病原RNA序列，結果表明:驢體內微生物分為細菌（95%）、古細菌（3%）和病毒（2%）三大類。細菌隸屬于14門22綱41目71科119屬。在門水平上，樣本中細菌物種組成豐度較高的有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、脫鐵桿菌門、梭桿菌門、疣微菌門，其中豐度最高的是變形菌門和厚壁菌門（圖1）。在綱水平上，細菌物種豐度大于5%的有丙型變形菌綱、芽孢桿菌綱、梭菌綱，其中丙型變形菌綱是優(yōu)勢細菌物種。在目水平上，細菌物種豐度大于5%的有腸桿菌目、乳桿菌目。在科水平上，細菌物種豐度大于5%的有腸桿菌、鏈球菌科。在屬水平上，腸桿菌屬是優(yōu)勢菌屬。

圖1 Illumina NovaSeq測序結果

2.3 小鼠致病性試驗結果

感染小鼠8 h后，試驗組開始有精神沉郁表現(xiàn)，食欲降低，肛門有稀糞，并開始出現(xiàn)死亡，病死率為80%。對照組小鼠精神狀態(tài)與飲水采食均正常且無死亡現(xiàn)象。

2.4 剖檢與病理組織學檢測結果

剖檢死亡小鼠可見肝臟、肺臟明顯出血，腸道脹氣，導致腸壁變薄（圖2）。涂片鏡檢均可見病原菌，經鑒定發(fā)現(xiàn)分離到的菌株與所接種菌株一致。

病理組織學觀察結果（圖3）顯示:心臟出現(xiàn)明顯的心肌細胞纖維變性，肌間毛細血管出血，部分心肌纖維肌漿空泡化；肺組織出現(xiàn)肺泡壁斷裂，肺泡塌陷，肺泡及間質充血、出血；肝細胞出現(xiàn)空泡變性，變性細胞胞漿淡染，其內出現(xiàn)大小不等微小空泡，胞核懸于中央或偏于一側；門管區(qū)周圍肝細胞呈片狀壞死，壞死細胞結構模糊，胞質粉染，胞核固縮、碎裂或溶解。

2.5 診療結果

采用制劑一治療后2周內，總體發(fā)病率從開始的42.3%降至18.8%（表1）。治愈率3組（白頭翁散）＞1組（制劑一）＞4組（乳酸環(huán)丙沙星注射液）＞2組（母子安散）（表2）。

表1 驢（駒）發(fā)病數(shù)與發(fā)病率統(tǒng)計

表2 各處理治療效果對比

3 討論與結論

近幾年，隨著國家對發(fā)展草食畜牧業(yè)的大力支持，作為典型草食畜牧業(yè)的特色驢養(yǎng)殖得到迅速發(fā)展，逐漸從役用轉向食用，但由于起步較晚，與其他畜禽規(guī)模化飼養(yǎng)場的精細飼養(yǎng)、生產效率仍有差距。本研究明確了目前從散養(yǎng)向規(guī)模化養(yǎng)殖過渡期危害驢場生產、導致經濟損失最主要的疫病是細菌病，條件性致病菌是主要病原，發(fā)生率多數(shù)與驢舍環(huán)境、養(yǎng)殖密度、飼料質量和管理水平等有直接關系。檢測結果發(fā)現(xiàn)病毒RNA含量中尾噬菌體目占比最高（27%），其次分別為皰疹病毒目（17%）、反轉錄病毒目（9%）、負鏈RNA病毒目（8%）、痘病毒科（7%）等，但只占總檢出病原的2%。細菌病給驢的規(guī)模化養(yǎng)殖帶來巨大的經濟損失，規(guī)模化養(yǎng)殖條件下如何科學防控細菌病值得關注［4－9］。

綜合在其他規(guī)模化驢場的采樣分析，細菌性病原導致的腹瀉在養(yǎng)殖場普遍發(fā)生，主要致病菌包括大腸桿菌、志賀氏菌等。其中大腸桿菌是引起腸炎和敗血癥的主要病原，也是引起驢駒嚴重腹瀉、肺炎，造成驢駒大量死亡的原因，病死率為20%左右［10］。參照其他物種致病性大腸桿菌毒力因子的檢測標準對驢源大腸桿菌進行分析，發(fā)現(xiàn)其沒有K88、K99、937P等毒力基因，采用新的MLST分型方法對分離到的菌株進行分型，目前分離到的菌株主要有ST88、ST410和ST11390。

隨著驢產業(yè)的不斷發(fā)展，現(xiàn)代規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖越來越多，當前疫病的發(fā)生也表現(xiàn)出多類型、復雜性等特征。為此，首先要做好預防，加強日常的飼養(yǎng)管理工作，定期對養(yǎng)殖場所進行消毒，減少病菌的滋生環(huán)境和傳播途徑。嚴格按照《畜禽養(yǎng)殖場消毒技術》（NY/T3075—2017），做好不同生產環(huán)節(jié)的消毒工作，尤其是產房內部清潔和消毒工作［11－13］。為保證消毒效果，要對消毒后的理化指標、殺滅微生物效果指標和毒理學指標進行檢驗。

通過對當前細菌性傳染病的防治方案療效和發(fā)病率比對，發(fā)現(xiàn)藥物療效易發(fā)生變化，細菌極易發(fā)生耐藥性，帶菌現(xiàn)象遷延不愈。因此需要及時調整措施科學防治［14－16］。經過1年的用藥效果分析發(fā)現(xiàn)，首選氨基糖甙類如卡那霉素、新霉素，配合喹諾酮類合成的環(huán)丙沙星、恩諾沙星等沙星類藥物，而阿莫西林、頭孢類的β－內酰胺類藥物使用后有耐藥性。抗生素可使用獸用硫酸卡那霉素注射液和乳酸環(huán)丙沙星注射液。必要時，服用蒙脫石、易蒙停或鞣酸蛋白等止瀉劑。同時保證足夠的奶水、維生素、氨基酸和鹽離子，在控制住病原和腹瀉癥狀后，使用短小芽孢桿菌與植物乳桿菌等驢源腸道的益生菌進行調理效果明顯。

目前有關驢的疫病國內外研究較少，驢疫病相關的基礎和應用研究薄弱，缺乏主要疫病的監(jiān)測和系統(tǒng)的流行病學調查，疫病的流行規(guī)律不清、病原的致病性及變異機理不明，尚未建立重要疫病病原變異與傳播的風險評估體系。本研究為驢場疫病的預防控制和凈化措施等提供了數(shù)據(jù)支撐。