免疫親和柱凈化-HPLC光化學柱后衍生法測定玉米中黃曲霉毒素B1的含量

◎ 尹安胤

（云南省德宏州質量技術監督綜合檢測中心，云南 德宏 678400）

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是黃曲霉和寄生曲霉的次級代謝產物，種類繁多，常見的有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中以黃曲霉毒素B1（AFB1）分布最廣、毒性最強、危害最大。AFB1主要污染糧油類食品，如花生、玉米、大米等，其中以花生和玉米污染最為嚴重[1]。1993年國際癌癥研究機構（IARC）已將AFB1定為I類致癌物，AFB1是目前最強的致癌化學物質之一，人體長期攝入含AFB1的食品會誘導肝癌等多種癌癥的產生，對健康造成巨大威脅，在歷年的《國家食品安全監督抽檢實施細則》中都將其列為重點檢測項目。

在《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中規定了玉米及其制品中AFB1的限量值為20 μg·kg-1[2]。目前我國對食品中AFB1的檢測主要以《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）的規定為主[3]，標準中規定了AFB1檢測的液相色譜串聯質譜法、高效液相色譜（柱前、柱后衍生）法、酶聯免疫吸附篩查法和薄層色譜法。其中，薄層色譜法操作復雜、步驟煩瑣、靈敏度低，屬于半定量方法，且試劑消耗較大，會對檢測人員身體健康造成較大危害[4]；酶聯免疫吸附篩查法實驗影響因素較多，容易出現假陽性，可靠性較差，無法實現精確定量，主要用于大批量樣品的篩查；液相色譜串聯質譜法雖然檢測靈敏度在幾種方法中最高，但設備昂貴、檢測和維護成本高且對檢測人員要求較高，在基層實驗室很難得到應用；高效液相色譜法具有靈敏度高、準確度高、操作簡單、檢測和維護成本較低等優點，因此仍為目前AFB1檢測的首選方法。本文采用免疫親和柱凈化-HPLC光化學柱后衍生法建立一種快速、準確檢測玉米中AFB1的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀-熒光檢測器，島津LC-20A、RF-20A；光化學衍生器，北京華安麥科生物科技有限公司；水浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；BS1254電子天平，德國賽多利斯股份有限公司；Maxi Mix Ⅱ渦旋振蕩器，賽默飛世爾科技有限公司；超純水機，密理博中國有限公司；0.22 μm針式濾膜，天津津騰實驗室設備有限公司；玻璃纖維濾紙（WHATMAN 1827-110），上海根生生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），默克化工技術（上海）有限公司；AFB1免疫親和柱（3 mL），北京華安麥科生物科技有限公司；甲醇中 AFB1標準溶液（20 μg·mL-1），默克 Supelco。

1.2 實驗樣品

玉米粉中黃曲霉毒素B1質控樣品，購自壇墨質檢標準物質中心。

1.3 色譜條件

色 譜 柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；流動相：甲醇∶水（45∶55）；進樣量：10 μL；熒光檢測器激發波長：360 nm，發射波長：450 nm。

1.4 提取與凈化

準確稱取10 g（精確到0.01 g）混合均勻的樣品于250 mL具塞碘量瓶中，加入2 g氯化鈉與100 mL提取液（70%甲醇-水溶液）混勻，置于搖床上以200 r·min-1劇烈振蕩20 min，用快速定性濾紙過濾并收集濾液，取10 mL濾液于小燒杯中并加入10 mL去離子水稀釋，再用玻璃纖維濾紙過濾，并收集濾液作為待凈化液。

取出免疫親和柱并使其恢復至室溫，連接10 mL注射器筒并固定在氣控操作架上，取10 mL待凈化液注入注射器筒中，去掉親和柱下方堵頭，調節氣流，使液體以1～2滴/s的速度流出，待液體排干后，用10 mL去離子水以2～3滴/s的流速洗滌2次，待液體排干后，用氣流吹去殘留液滴，加入1 mL甲醇以1滴/s的流速洗脫，收集洗脫液于10 mL刻度離心管中并定容至1 mL。洗脫液用0.22 μm針式濾膜過濾至色譜進樣小瓶中供液相色譜測定，與標準系列比較，外標法定量。

1.5 標準曲線的繪制

準確吸取 AFB1標準溶液（20 μg·mL-1）0.1 mL 于25 mL棕色容量瓶中并用乙腈定容，配制成80.0 ng·mL-1的中間液，再用乙腈稀釋得到 2.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL、40.0 ng·mL-1和 80.0 ng·mL-1的標準系列工作溶液。將工作溶液注入液相色譜中，按照1.3中的色譜條件進行測定，以標準系列工作液的濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標，得到標準曲線回歸方程。AFB1的標準色譜圖見圖1，標準曲線見圖2。試樣中AFB1含量按公式（1）和（2）計算：

圖1 AFB1標準色譜圖

圖2 AFB1標準曲線圖

式中，X-試樣中AFB1的含量，μg·kg-1；m-稱取試樣質量，g；c-進樣溶液中AFB1在標準曲線上對應的濃度，ng·mL-1；V-樣品經免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，mL；f—稀釋倍數；V1-加入的提取液體積，mL；V2-稀釋用樣品濾液的體積，mL；V3-加入稀釋液的體積，mL；V4-注入免疫親和柱的待凈化液體積，mL。

本實驗中稀釋倍數f=20，保留時間為16.7 min，經計算得試樣中 AFB1含量為 17.2 μg·kg-1。

2 結果與分析

2.1 免疫親和柱的應用

本文采用免疫親和柱進行凈化處理。AFB1免疫親和柱的原理是抗原抗體反應，抗體連接在柱體內，樣品中的AFB1經過提取、過濾、稀釋后緩慢通過AFB1免疫親和柱，在免疫親和柱內AFB1與抗體結合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結合的其他雜質。最后用甲醇洗脫AFB1供液相色譜上機檢測。免疫親和柱可選擇性地吸附樣品提取溶液中的AFB1，從而對樣品提取溶液起到針對性的純化作用[5]。免疫親和柱凈化法樣品色譜圖雜峰較少、峰型對稱、基線平穩（圖3），回收率高，樣品凈化過程操作較為簡單快速，可有效提高檢測方法的靈敏度和準確度。

圖3 免疫親和柱凈化后樣品色譜圖

2.2 光化學柱后衍生的效果

由于AFB1在水溶液中會發生熒光淬滅，在進行高效液相色譜法測定前要進行衍生化處理[6]。在《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）中規定了柱前衍生和柱后衍生兩種衍生方法。柱前衍生法操作過程煩瑣，衍生化過程中易引入雜質和干擾峰，可能造成目標化合物的損失。本文采用柱后光化學衍生法，該法操作簡單，設備成本低，只需在柱后連接光化學衍生器，通過紫外光照射可使樣品溶液中的AFB1熒光特性顯著增強，從而有效提高方法的靈敏度。

2.3 線性范圍、相關系數和檢出限

本實驗中AFB1濃度在2.5～80.0 ng·mL-1范圍內呈良好線性關系，AFB1的標準曲線回歸方程為Y=2.08×10-5X+0.411，相關系數r=0.999 9。隨試樣同時做空白試驗，以3倍信噪比計算出檢出限為0.05 μg·kg-1。

2.4 精密度與回收率實驗

選取一個加標樣品按照免疫親和柱凈化法處理后重復測定6次，根據AFB1峰面積計算出相對標準偏差（RSD），結果見表1。從由表1數據可知，RSD為2.17%，表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗結果表

用已知AFB1含量的玉米粉樣品制備3個添加水平的加標樣品：5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1，每個水平制備6個平行樣，按照免疫親和柱凈化法處理后上機測定，分別計算回收率和RSD，結果見表2。從表2數據可知，3個添加水平下的平均回收率為88.5%～94.3%，RSD為1.96%～2.57%，表明該方法的準確度良好。

表2 回收率試驗結果表

3 結論

本文建立了玉米中AFB1的免疫親和柱凈化-HPLC光化學柱后衍生測定方法，免疫親和柱能選擇性地識別和富集AFB1，光化學柱后衍生能夠顯著增強AFB1的熒光特性，可有效提高靈敏度，樣品加標回收率為88.5%～94.3%。該方法具有操作簡便、快速、穩定性好、回收率高等優點，能夠滿足玉米及其制品中AFB1含量的快速測定需求。