高效液相色譜法測(cè)定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法研究

◎ 劉 霞

（六安市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 六安 237000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又稱為嘔吐毒素，是鐮刀菌的次要的生產(chǎn)代謝的產(chǎn)出物，性質(zhì)十分穩(wěn)定，且具有一定的耐熱、耐壓及耐弱酸和耐儲(chǔ)藏的特點(diǎn)，所以在普通的食品加工過程中，一般情況下無法破壞其本身結(jié)構(gòu)，如果對(duì)其加入堿或者是進(jìn)行一些特殊的高壓步驟，則會(huì)破壞其中的一些毒素。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是糧食檢測(cè)中十分重要的安全指標(biāo)，是糧食中十分危險(xiǎn)的自然污染物之一[1]，分布特別廣泛，因此小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的存在不可避免，當(dāng)人們誤食了含有DON的食物時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉等中毒癥狀，有情況嚴(yán)重者甚至可能會(huì)死亡。由于其具有一定的危害性，對(duì)此各個(gè)國(guó)家都制定了一系列嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。比如加拿大規(guī)定，牛和雞的飼料中DON含量不能超過5 mg·kg-1，在豬和小牛的飼料當(dāng)中不能超過1 mg·kg-1；澳大利亞規(guī)定了黑麥當(dāng)中的DON含量不可超過0.5 mg·kg-1；我國(guó)規(guī)定了谷物當(dāng)中的DON含量不能超過1.0 mg·kg-1。

伴隨著人們食品安全意識(shí)的提高，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的相關(guān)檢測(cè)工作也得到了重視，因此脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道也在不斷增加。常用的檢測(cè)方式有4種，包括同位素稀釋液相色諧-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、薄層色譜測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法。目前，免疫親和層析凈化高效液相色譜法是一種最為有效也最能準(zhǔn)確定量的檢測(cè)方法，通過免疫性親和柱可以把脫氧雪腐鐮刀菌烯醇更好地從谷物和相關(guān)制品中進(jìn)行有效分離，凈化效果明顯。但是此方法種前處理的相關(guān)研究報(bào)道十分稀少，本次實(shí)驗(yàn)選擇了適用于多種類別食品檢測(cè)的免疫親和層析凈化-高效液相色譜法，研究了小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定的線性范圍及回收率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售小麥粉；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱；色譜純甲醇、乙腈。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-20A高效液相色譜儀；紫外檢測(cè)器；臺(tái)式高速離心機(jī)；超聲波清洗儀；固相萃取裝置；氮吹儀

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

稱取小麥粉25 g置于100 mL離心管中，加入5 g聚乙二醇，加水100 mL，混合均勻，置于超聲波清洗儀中超聲20 min，后放入離心機(jī)，10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。取上清液2 mL過脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱，然后使用磷酸鹽緩沖溶液和水進(jìn)行淋洗，加入2.0 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，50 ℃下氮?dú)獯抵两桑尤?.0 mL初始流動(dòng)相，溶解殘?jiān)瑴u旋混勻，過濾膜，待測(cè)[2]。

1.3.2 色譜條件

色 譜 柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水=20∶80；紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃。

1.3.3 回收率的測(cè)定

稱取6組空白樣品，分別加入不同含量的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.1的方法進(jìn)行前處理操作，采用免疫親和層析凈化-高效液相色譜法對(duì)樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

經(jīng)液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的保留時(shí)間為 9.312 min，在 0.1 ～ 5.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，線性方程為：y=76 368.1x+1 286.80，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

圖2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 免疫親和層析凈化法的加標(biāo)回收率

采用免疫親和柱進(jìn)行凈化，按照前述處理方法及儀器測(cè)定條件，測(cè)定不同加標(biāo)量的回收率，加標(biāo)樣品的色譜圖及回收率測(cè)定結(jié)果分別見圖3和表1。

圖3 加標(biāo)樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的色譜圖

表1 不同加標(biāo)量的回收率表

3 結(jié)論

本文采用免疫親和層析凈化高效液相色譜法，對(duì)小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在0.1～5.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。而回收率在不同添加濃度上存在一定差別，可能是提取液在免疫親和柱上的流速不同導(dǎo)致的[3]。

免疫親和柱的作用原理是根據(jù)抗原抗體的特異性進(jìn)行結(jié)合[4]，在柱體中加入可以與特異性抗體相結(jié)合的凝膠物質(zhì)，將待測(cè)物吸附出來。待測(cè)提取液需緩緩均勻地經(jīng)過凈化柱，在提取液完全經(jīng)過柱體后，再對(duì)該柱體進(jìn)行抽干，最后加入洗脫液進(jìn)行淋洗洗脫。在此過程中，若提取液在柱體表面流動(dòng)過快，免疫親和柱中的特異性抗體就不能及時(shí)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇相結(jié)合，被吸附的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的數(shù)量比實(shí)際數(shù)量少，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就會(huì)偏低。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)小麥粉進(jìn)行了相應(yīng)的研究，但是相比于其他食品，如大米，食用性植物油等產(chǎn)品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[5]含量的檢測(cè)仍需進(jìn)一步研究才能確定。

對(duì)于檢測(cè)數(shù)量稀少的樣品，需要通過均質(zhì)法進(jìn)行樣品前處理，這樣能夠達(dá)到快速和準(zhǔn)確檢測(cè)的效果。對(duì)大批量樣品的檢測(cè)工作而言，通過振蕩提取的方式不僅能夠保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，也節(jié)省了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間成本。同時(shí)，樣品的細(xì)度對(duì)于樣品檢測(cè)的結(jié)果影響也很大，在樣品經(jīng)過了研磨以后，篩子的孔徑過小或是過大，都會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物提取不充分。因此，應(yīng)當(dāng)選擇恰當(dāng)?shù)暮Y子孔徑。