食品中硼酸測定標準曲線制作注意事項探究

◎ 魏文強，李亞平

（通渭縣食品藥品檢驗檢測中心，甘肅 通渭 743300）

硼酸是一種含硼化合物，硼酸曾廣泛作為食品添加劑用于面制品、肉制品、水產品中，硼元素也是人體必需的微量元素，但是硼含量超過限量時，會對人體造成不同程度的毒害[1-4]，成人每日允許最大攝入的硼含量為 0.3 mg·kg-1·d-1[5]，原衛生部在 2008 年發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單》明確禁止硼酸在食品中添加，即任何食品中不得檢出[6]。目前，我國食品中硼酸的檢測方法依據《食品安全國家標準 食品中硼酸的測定》（GB 5009.275—2016），本方法通過乙基己二醇-三氯甲烷溶液對食品中的硼酸進行富集，再用姜黃素-冰乙酸對食品中硼酸進行顯色，溶液顏色的深淺與所測定食品中的硼酸含量成正比，可以通過紫外分光光度計定量測定食品中的硼酸[7]。在整個測定過程中，對標準曲線繪制尤為重要，其直接能夠影響到最終食品測定結果的準確與否，但在實際食品中硼酸的測定過程中經常出現標準曲線線性不好，相關系數R值達不到實驗室要求的問題，為探究導致以上問題的原因，提高工作效率，本文按照試驗步驟，分析總結試驗測定過程中的注意事項。

1 材料與方法

1.1 試劑

硼酸標準溶液（5 μg·mL-1）、無水乙醇（分析純）、2-乙基-1,3-己二醇（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、冰乙酸（分析純）、姜黃色素、三氯甲烷（分析純）、濃硫酸（分析純）和蒸餾水。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計（UV8000s），購自上海元析儀器有限公司；電子天平（Quintix224-1CN，感量0.1 mg），購自德國賽多利斯科學儀器有限公司；渦旋振蕩器（HD-2500），購自杭州佑寧儀器有限公司。

1.3 試驗方法

（1）準確吸取硼酸標準溶液（5 μg·mL-1）0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL于25 mL塑料試管中，各加水至5 mL。加硫酸溶液（1+1）1 mL，振蕩混勻，加EHD-CHCl3溶液5.00 mL，蓋上蓋子，渦旋振蕩器振搖2 min，靜置分層，吸取下層的EHDCHCl3溶液并通過φ7 cm干燥快速濾紙過濾。

（2）各取1.00 mL過濾液于50 mL塑料試管中，依次加入姜黃-冰乙酸溶液1.0 mL，硫酸0.5 mL，搖勻，靜置30 min，加無水乙醇25 mL，靜置10 min，于550 nm處1 cm比色皿測定吸光度。以標準系列的硼酸含量（μg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 姜黃色素溶解效果對標準曲線線性的影響

分別選用未經超聲溶解的姜黃素-冰乙酸和經超聲促進溶解的姜黃素-冰乙酸作為顯色液，其他試劑和試驗條件保持一致進行標準曲線的測定，測定結果見表1。未經超聲溶解的姜黃素-冰乙酸作為顯色液，做出的標準曲線線性和R2值均比經超聲促進溶解的姜黃素-冰乙酸作為顯色液所繪制的標準曲線差。所以在姜黃色素較難溶解的情況下，可以先加適量的冰乙酸，超聲促進溶解，然后再定容至100 mL，以保證標準曲線的線性關系良好。

表1 使用不同溶解效果的姜黃素顯色后的吸光度值表

2.2 2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液配制時間對標準曲線線性的影響

為了驗證2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液放置時間的長短對標準曲線線性的影響，在其他試劑和試驗條件保持一致的情況下，選用現用現配的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液和提前配制好，但已經放置了12 h、24 h的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液進行標準曲線的測定，結果見表2。使用不同配制時間的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液對標準曲線的線性影響較大，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液放置時間過久會造成標準曲線的線性較差，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液應現用現配。

表2 使用不同配制時間的2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液顯色后的吸光度值表

2.3 試驗過程中使用的濃硫酸的開啟時間對標準曲線線性的影響

硼酸測定過程中長時間使用同一瓶的濃硫酸，由于濃硫酸易吸水，會造成濃硫酸的濃度下降，為了驗證試驗過程中所使用的濃硫酸開啟時間對標準曲線線性的影響，在其他試劑及試驗條件保持一致的情況下，使用相同品牌、同一批次但打開時間不同的濃硫酸，進行標準曲線的測定，結果見表3。使用相同品牌、同一批次但打開時間不同的濃硫酸對標準曲線的線性影響較大，使用打開時間越長的濃硫酸，顯色反應顏色會越淺，標準曲線的線性也會更差，造成最終的檢測結果不準確。

表3 使用開啟時間不同的濃硫酸顯色后的吸光度值表

2.4 含有2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液的不同容積的塑料試管對硼酸富集、萃取效果的標準曲線線性的影響

《食品安全國家標準 食品中硼酸的測定》（GB 5009.275—2016）中5.2要求吸取硼酸標準系列溶液于25 mL塑料試管中，然后進行后續操作。但在實際試驗過程中發現，相較于25 mL的塑料試管，選用50 mL的塑料試管做出的標準曲線線性更好，這可能是因為塑料試管容量變大，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液對硼酸富集、萃取效果變好。為了驗證該因素的影響，在其他試劑及試驗條件保持一致的情況下，分別選用50 mL塑料試管、25 mL塑料試管，進行標準曲線測定，結果見表4。選用50 mL的塑料試管富集、萃取硼酸做出的標準曲線線性優于選用25 mL的塑料試管。選取50 mL的塑料試管可以使2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液與標準系列溶液混合更為均勻，對硼酸的富集、萃取更為有效，標準曲線的線性更好。

表4 選用不同容積規格塑料試管富集、萃取硼酸后的吸光度值表

3 結論

分光光度法測定食品中硼酸的測定步驟較為復雜，在硼酸標準曲線的制作過程中應注意以下幾點。

（1）姜黃素-冰乙酸溶液作為顯色溶液，對標準曲線的線性有很重要的影響，在配制過程中姜黃色素較難溶解，可以先加適量的冰乙酸，超聲促進溶解，然后定容至100 mL，此溶液也必須保存于塑料容器中，因為在強酸條件下，含硼酸鹽的玻璃器皿不穩定，可以將硼酸鹽轉化為硼酸溶液，使用塑料容器可以避免帶入外源性的硼。

（2）2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液因為含有三氯甲烷，三氯甲烷在光照下不穩定，放置時間過長，導致硼酸標準系列梯度不明顯，標準曲線線性不好，相關系數R值達不到實驗室要求，因此，2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液要現配現用。

（3）試驗過程中所使用的濃硫酸易吸水而導致濃度下降，反復使用，會使最后的顯色反應梯度不佳，最終造成標準曲線的線性不好、相關系數R值達不到實驗室的要求，所以應保證濃硫酸的密封性，或者盡量使用新打開的濃硫酸。

（4）選用50 mL的塑料試管做出的標準曲線線性優于選用25 mL的塑料試管，最終做出的標準曲線線性良好，相關系數R值普遍能達到0.99以上，符合實驗室的要求，所以建議將標準溶液系列加入到50 mL的塑料試管中，之后再進行后續操作，以提高檢測結果的準確性。