基于陳糧中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇盲樣考核的檢測關鍵點分析

◎ 荊輝華，向 俊，陳同強，李 宏，鄒子爵，王亮亮

（1.湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410000；2.食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是一種常見的真菌毒素，具有較強的細胞毒性，攝入后易引起急、慢性中毒，表現為惡心、嘔吐及中樞神經系統紊亂等，所以又名嘔吐毒素，是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等真菌產生的次級代謝產物[1-4]。DON作為全球污染較高的真菌毒素之一，主要存在于小麥、大麥、燕麥、玉米等糧食作物中[5-7]。目前，主要國家和地區都制定了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量標準[8-9]。DON在我國糧食中檢出非常普遍[10-13]。我國《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中規定谷物及其制品的限量為1 000 μg·kg-1，具體類別包括玉米、玉米面（渣、片）、小麥、大麥、麥片及小麥粉[14]。谷物及其制品作為人們最重要的糧食來源，其質量應得到有效控制及保障。準確檢測是質量控制的重要前提，檢驗機構應發揮自身的優勢，為我國真菌毒素污染水平的客觀評價及相應管控措施的實施提供可靠的技術支撐。檢驗機構還應不斷提高檢測能力和水平，更好地發揮檢驗檢測對高質量發展的技術指導作用，提高產品質量，保障食品安全。

盲樣考核是評估和提高檢驗實驗室檢測技術水平的重要手段，是實驗室質量控制的重要環節，可直接、客觀地反映實驗室的檢測能力，也是國家市場監管總局為保障產品質量，考核并提升相關檢驗檢測機構技術能力的重要手段。林芳等[15]對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇能力驗證結果進行統計，其重點是分析樣品的均勻穩定性和結果統計的科學性，本文重點從檢測的角度，分析檢測過程中的注意事項及檢測關鍵點，提高實驗室真菌毒素的檢測能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢測的樣品為陳糧，由中國食品藥品檢定研究院提供，共5瓶，編號分別為A、B、C、D、E，每瓶約60 g。質控樣品（基質為玉米），DON免疫親和柱。DON標準溶液（200 mg·L-1），O2Si，乙腈、甲醇、乙酸銨（色譜純，上海安譜），水為Millipore凈化的超純水。

1.2 儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Agilent1260 Infinity高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SCIEX QTrap 4500液質聯用儀（美國AB公司）；Milli-Q Reference mili-Q advanced A10超純水儀（美國Millipore公司）；CM-1000高速振蕩器（東京理化器械株式會社）；BSA224s電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；Multifuge X1R高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 HPLC法前處理

稱取5 g樣品，定量加純水25.0 mL，渦旋振蕩20 min，超聲提取 5 min，8 000 r·min-1離心 5 min，取上清液，待凈化。將DON免疫親和柱放置至室溫，置于高通量固相萃取儀上，待免疫親和柱中原有液體流出后，準確移取2.0 mL濾液于免疫親和柱中，控制流速1 滴/s的速度通過免疫親和柱。用5 mL磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate Buffered Solution，PBS）和5 mL去離子水先后淋洗免疫親和柱。直至空氣進入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱。加入2 mL甲醇洗脫，流速控制在1 滴/s，收集洗脫液于10 mL離心管中，40 ℃氮氣吹至近干，用1.0 mL初始流動相渦旋溶解，經0.22 μm濾膜過濾后，待高效液相色譜儀測定。

1.3.2 HPLC-MS法前處理

稱取2 g試樣于50 mL離心管中，加20.0 mL乙腈-水溶液（84∶16，V/V），渦旋振蕩20 min，超聲5 min，8 000 r·min-1離心5 min，收集上清液。準確移取5.0 mL上清液置于10 mL離心管中，于40～50 ℃氮氣吹干，加入2 mL水充分溶解殘渣，過免疫親和柱，步驟同HPLC。加入1.0 mL20%甲醇，渦旋30 s溶解殘留物，0.22 μm濾膜過濾，待液質聯用檢測。

1.3.3 色譜條件

（1）HPLC方法條件。色譜柱：Agilent C18柱，規格為4.6 mm×150 mm；進樣量50 μL；柱溫35 ℃；流動相：甲醇+水（20+80），流速0.8 mL·min-1；等度洗脫，檢測波長218 nm。

（2）HPLC-MS方法條件。色譜柱：Thermo Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；進樣量5 μL；柱溫35 ℃；流動相：A相為乙腈，B相為5 mmol·L-1乙酸銨溶液，流速0.2 mL·min-1；梯度洗脫：20%A（0～ 1.0 min），90%A（4.0～ 7.5 min），20%A（7.6～12.0 min）。離子源模式：ESI-，多反應監測（MRM），毛細管電壓：4 500 V，離子源溫度500 ℃，噴霧器：40 psi，輔助氣：50 psi，碰撞氣：30 psi。其余參數見表1。

表1 DON的定量、定性離子對及質譜分析參數表

1.3.4 主要影響因素考察及內部質量控制

主要因素試驗考察包含上機溶劑選擇、標準品量值核查、免疫親和柱驗收；質量控制試驗包含預實驗、樣品均勻性試驗、方法比對、儀器比對、人員比對、重復性試驗和質控樣測定。

2 結果與分析

2.1 試驗中主要的影響因素考察

2.1.1 樣品復溶溶劑的選擇

由圖1可知，HPLC法檢測選用甲醇、初始流動相甲醇/水（20/80）作為樣品的上機溶劑，發現采用純甲醇溶解目標物峰嚴重的展寬，采用流動相溶解的DON峰型較好。由圖2可知，在HPLC-MS檢測中，純甲醇配制的目標物峰嚴重展寬，信號明顯降低，20%甲醇復溶樣品則峰型較好，響應較高。表明DON存在較強的溶劑效應。采用液相及液質檢測真菌毒素時，通常存在溶劑效應，如果直接采用洗脫溶劑上機，會造成目標峰峰型差，嚴重影響定性及定量，檢測中應注意將目標物洗脫后進行溶劑轉換，選擇與初始流動相匹配的復溶溶劑。

圖1 DON的液相色譜圖（溶劑為甲醇和20%甲醇）

圖2 DON的液質聯用離子色譜圖（溶劑為甲醇和20%甲醇）

2.1.2 標準品量值核查

選用了實驗室現有的均在有效期內的3種標準品進行比對，來源均為O2Si，濃度為200 mg·L-1，標準品的溶劑為甲醇、乙腈及乙酸乙酯∶甲醇=95∶5，分別采用20%甲醇稀釋配制成濃度為200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1000 ng·mL-1的稀釋液，重復進樣 2 次，比較同一濃度的標準品的峰面積。結果顯示不同標準品之間同一濃度的峰面積RSD均小于5%。甲醇、乙腈為溶劑的標準品色譜圖一致（圖3A）。但溶劑為乙酸乙酯∶甲醇=95∶5的標準品存在較大的干擾峰（圖3B），經驗證為溶劑乙酸乙酯的峰（圖3C），檢驗中應注意區分標準品中目標物及溶劑峰，防止錯認。

圖3 不同標準品的DON色譜圖和乙酸乙酯色譜圖

在DAD檢測器中還可以利用光譜進行區分，如圖4A所示，DON在波長218.5 nm處有較大吸收，光譜圖明顯區別于溶劑干擾峰圖4B。如果標準品中溶劑與配制的溶劑不互溶，配制時應注意溶劑轉換。

圖4 DON的光譜（A）和干擾峰的光譜（B）圖

標準品量值準確是確保準確檢測的前提，鑒于現在市場上所供應的商品化標準物質的純度、含量可能存在一定的差異性，直接影響到微量檢測結果的準確性。目前，一些國標增加了實用的標準物質濃度的校正方法，如在GB 5009.22—2016中，黃曲霉毒素B族和G族檢測中增加了標準液濃度的校正方法，沒有標準溶液的校正方法時，可采用不同廠家的標準物質比對、質控樣測定等方式進行標準品的量值核查，確保量值準確。

2.1.3 前處理器皿污染干擾

前處理過程應注意設備及器皿的潔凈度，DON前處理采用免疫親和柱凈化效果好，HPLC圖譜中基本無干擾，但試驗中發現全自動氮吹儀的氮吹管中有污染物殘留，會導致液相色圖譜上目標物的位置有雜鋒干擾，嚴重影響定性及定量。可能由于DON檢測波長較短，許多組分在該波長下都有吸收。試驗中應注意用完及時清洗，保持氮吹管潔凈干燥，不直接接觸溶液，緩慢調節氣流，防止液體飛濺，以免造成目標組分的污染及損失。

2.1.4 免疫親和柱驗收

免疫親和柱驗收包含了柱容量、回收率的驗收，GB 5009.111—2016[16]要求DON柱容量≥1 000 ng，回收率≥80%。試驗中使用了兩款不同的免疫親和柱，采用HPLC法進行驗收時，結果顯示免疫親和柱A結果普遍高出免疫親和柱B結果，且部分回收率超出120%，經空白試驗驗證免疫親和柱A存在本底值，且經HPLC-MS測定該批次免疫親和柱本底值絕對含量達100～200 ng，因存在稀釋因子，該影響在計算后導致最終結果差別較大。

試劑耗材驗收也是確保結果準確的前提，每批免疫親和柱使用前應進行驗收，除柱容量及回收率滿足檢測要求外，還要注意本底殘留。在實際檢測中，如發現有含量較高的樣品，還應考慮免疫親和柱過載問題，若可能過載，則需減少移液體積或稀釋后移取部分液體，重新凈化，以得到準確含量。

2.2 預試驗

正式檢測前，先對盲樣進行預試驗測定，采用HPLC法，取樣量2 g，提取溶劑按比例減少，上柱液體積為2.0 mL，標準曲線線性范圍為100～1 000 ng·mL-1。預試驗測得的樣品濃度為171～841 ng·mL-1，濃度處于線性范圍內，計算樣品含量為400～2 000 μg·kg-1，上機濃度顯示免疫親和柱未過載。對于低含量的樣品可適當增加過柱體積，增加儀器響應以降低測定的誤差。

預試驗是盲樣考核中非常重要的環節，根據預試驗中獲得樣品中檢測組分的大致含量，可確定適宜的取樣量、前處理上柱體積、定容體積、加標范圍、標準曲線的配制范圍及合適的質控樣品，并明確樣品是否需要濃縮或稀釋后進行測定。

2.3 樣品均勻性試驗

樣品均勻是保障試驗結果準確及其他質控措施有效的重要前提，因獲得的盲樣樣品粒度大小存在差異，首先對樣品的均勻性進行考察，采用HPLC法檢測，分別取10 g樣品，提取溶劑50 mL和取5 g樣品，提取溶劑為25 mL進行比對，平行測定2次，結果見表2。結果顯示，取樣量為10 g和5 g的測定結果差異較小，RSD在0.46%～2.49%，含量低的樣品RSD差異稍大，表明樣品的均勻性良好。

表2 樣品均勻性測定表

2.4 方法比對

采用HPLC法及HPLC-MS法進行比對試驗，平行測定2次，結果見表3。由表3可知，5組樣品HPLC法測定的樣品含量結果為471.0～1 850 μg·kg-1，HPLC-MS法檢測結果高于HPLC，其樣品含量為513.7～2 013μg·kg-1，且每組樣品的RSD較HPLC大。為探究HPLC-MS方法結果普遍高于HPLC的原因，兩者提取溶劑不同，檢測器不同，將液相法前處理樣品用液質檢測，發現同一樣品液的HPLC-MS結果高于HPLC法，表明結果差異主要來源于儀器，而非前處理過程。同時，也表明兩種前處理方式對DON的提取較完全。該結果與姚霞等[17]采用玉米基質進行方法比對所得結果類似，即HPLC-MS法所測得結果高于HPLC法，可能在HPLC-MS法檢測中，存在基質增強效應。因未找到空白的盲樣基質，未做基質加標曲線驗證，但基質效應在HPLC-MS檢測中非常常見，一般表現為基質增強或基質減弱[18-19]，樣品經過凈化后仍然可能存在糖類、肽類有機化合物、無機鹽雜質等物質干擾目標物電離，影響離子化效率，采用空白樣品基質配制標準曲線可降低基質干擾。HPLC-MS法靈敏度高，抗干擾能力好，穩定性要低于HPLC法，但檢測中應注意基質效應影響。

表3 不同檢測方法結果比較表

2.5 儀器比對

試驗中用Waters和Agilent液相色譜儀比對測定DON，儀器比對采用同一前處理樣品在不同儀器進樣，結果顯示，RSD檢測結果均小于5%，差異性小，且都能滿足定性定量要求，但DON在不同儀器上的響應稍有差別，這可能與不同儀器中檢測器的設置有關，Waters以AU為單位，Agilent以mAU為單位，同一濃度水平的DON，Agilent中的圖譜信號稍高，基線平穩，儀器噪音小，更易直觀地判斷目標物，如圖5、圖6所示。實驗室可根據實際情況結合儀器對目標物的響應加以選擇。但無論采用哪種儀器，確保基線穩定，柱效分離度及峰型良好，儀器靈敏度滿足要求。

圖5 DON的（Agilent）液相色譜圖

圖6 DON的（Waters）液相色譜圖

2.6 人員比對

人員比對采用HPLC法在同一臺儀器進行，每組樣品平行測定2次，所得結果見表4。結果顯示人員比對的同組樣品的RSD在1.99%～5.69%，對于含量較高的樣品，測定差值較小。不同檢測人員因檢驗習慣、規范程度，對檢測方法理解及操作要領掌握的不同，可能會帶來結果的差別。重要考核中人員比對試驗可安排具備豐富經驗和良好技術水平的不同人員進行，不同人員對結果進行確認可增加結果的可信度，人員比對可作為日常檢驗活動中質量控制的一種重要手段。

表4 人員比對結果表

2.7 加標試驗

本次試驗用陳糧，因樣品的量有限，且真菌毒素在樣品中分布可能存在不均情況，試驗中采用同一樣品的提取液加標，選用含量較低D樣品的提取液加標，添加3水平，平行測定2次，結果見表5。由表5可知，HPLC法的回收率在92.4%～103%，HPLC-MS法的回收率在99.2%～119%，HPLC-MS法回收率高于HPLC法。標準加入的目標物其與樣品的結合作用異于樣品本身所含有的，并不能真實反映樣品的提取環節，但為減少誤差，試驗中宜采用相同基質加標；沒有相同基質情況下，可采用近似樣品基質，加標后注意放置一段時間，讓標準品與樣品充分混合作用，標準加入量應接近樣品的真實含量，但應注意不超過免疫親和柱的柱容量。

表5 加標試驗結果表

2.8 質控樣的測定

試驗中選取了兩種質控樣，質控樣A為新采購的樣品，質控樣B為已開封半年，并按條件保存的樣品，基質均為玉米。結果見表6。由表6可知，A的測定值在參考值范圍內，B則低于參考值范圍，參照GB/T 27404—2008要求[20]，真值含量在0.010～10 mg·kg-1，偏差范圍為-20%～+10%，質控樣B不滿足要求，這可能為質控樣B已開封半年，且經多次使用，導致樣品因吸潮或在不確定的溫度條件下真菌毒素含量發生了變化。因此，質控樣應選擇與樣品相同或相近的基質，結果分析時，應首先確保質控樣是按規定的條件保存，后續使用應注意監測其含量變化。

表6 質控樣測定結果表

2.9 結果報送

因HPLC-MS檢測結果偏高，試驗中未找到相似空白基質曲線進行校正，本次考核重點參考HPLC的檢測結果，充分考慮樣品均勻性測定、人員比對、儀器比對的試驗結果，采用多次測定的平均值報送。

3 結論

本次盲樣考核獲得滿意結果，標準品核查、試劑耗材驗收是確保結果準確的重要前提，加標試驗可評估方法及操作的有效性，采用合理的質控樣測定是評估結果準確性的有效手段。人員比對、儀器比對可進一步增加結果的可靠性。實驗室應根據自身條件選擇合適的方法、儀器，準確把握前處理中的關鍵點，采用多種質控方式相結合，確保結果的準確性。

盲樣考核能有效反應實驗室的技術水平，本實驗室以盲樣考核為有效質控手段，總結經驗，明確試驗操作中的關鍵點，確保了盲樣考核結果的有效性和可靠性，實驗室編寫了該檢驗項目的操作要領及關鍵點，本實驗室在后續的DON能力驗證、赭曲霉毒素A國際能力驗證等真菌毒素考核中都取得滿意結果。同時，本文中所總結的經驗及DON檢測關鍵點，同樣適用于其他真菌毒素的測定。