濁點萃取響應(yīng)面優(yōu)化山楂總黃酮提取工藝

孟慶華,張光輝

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) ,陜西 咸陽 712046)

山楂為薔薇科植物山里紅、山楂或野山楂的干燥成熟果實，主產(chǎn)于山東、河北、河南、遼寧、江蘇[1]?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，山楂中含山楂酸、黃酮類、內(nèi)酯、糖類、甙類、蛋白質(zhì)及鈣、磷、鐵等人體必需元素[2～3]。山楂具有消食健胃，行氣散瘀之功效[4]。山楂黃酮提取目前多為醇提法，郭艷華[5]等考察了浸提時間、溫度、料液比、酸度等對提取山楂中總黃酮含量的影響；王珊珊[6]等通過單因素試驗與響應(yīng)面模型設(shè)計分析不同乙醇濃度、提取溫度、超聲時間和料液比對山楂總黃酮提取率的影響；劉煊崴[7]等采用索式提取法，通過單因素及正交試驗考察了甲醇濃度、提取時間以及料液比對提取效果的影響。濁點萃取是利用濁點原理與表面活性劑的增溶作用對待分離組分進行富集的一種新型的液-液萃取技術(shù)，李凱龍[10]等通過濁點富集萃取方法對蔬菜中天然維生素K、同系物葉綠醌(PK)和四烯甲萘醌(MK-4)，并通過液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法對其進行了檢測；陳邈[11]等通過濁點萃取-高效液相色譜法對化妝品中4種合成酚類抗氧化劑進行了檢測。藥用山楂主要有炒山楂、焦山楂、山楂炭和生山楂幾種，炮制方法不同，功效有所差異。本項目采用濁點萃取法，考察山楂炮制方法對山楂黃酮含量的影響。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV1780紫外分光光度計(日本島津)；Avanti JXN-30/26高效離心機(美國貝克曼庫爾公司)；超聲波清洗機XC-400(濟寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司)；恒溫水浴鍋(上海一凱儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑

蘆丁對照品(批號100800-201506，中國藥品生物制品檢定所)；化學(xué)試劑(AR，南京化學(xué)試劑股份有限公司)；山楂藥材購于陜西西安地區(qū)，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室王繼濤老師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 濁點萃取山楂中總黃酮

將山楂烘干去籽粉碎，過60目篩，精密稱取山楂粉20.0 g置于燒杯，向其中加入200 mL聚氧乙烯脂肪醇醚(Genapol-X80)，攪拌均勻，400 W超聲30 min后，800轉(zhuǎn)離心5 min，取上清液加NaCl溶液適量混均勻，60 ℃水浴30 min，800轉(zhuǎn)離心10 min至溶液清晰分為兩層，分液漏斗分離去下層水相，上層有機層中加入20 mL乙醇降低黏度，用超濾膜過濾，回收聚氧乙烯脂肪醇醚，濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，得山楂黃酮提取物。

2.2 山楂黃酮含量測定

2.2.1 標準曲線繪制 精密稱取0.0100 g蘆丁標準品，加無水乙醇溶解定容至100 mL，配制成濃度為0.10 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。取6個10 mL容量瓶分別編號，精密移取蘆丁標準溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL分別注入1～6號容量瓶，再分別加入0.30 mL 5%亞硝酸鈉、0.30 mL 10%硝酸鋁，搖勻靜置5 min充分反應(yīng)后，滴加2.00 mL 4%氫氧化鈉[16]，用無水乙醇定容至10 mL，得到不同濃度的標準溶液。以1號為空白，于507 nm處測定吸光度(A)[17]。以吸光度A為縱坐標，濃度C(mg·mL-1)為橫坐標，繪制回歸曲線，回歸方程為A=9.277C+0.0026，r=0.9986，證明蘆丁標準品在0.01～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

2.2.2 山楂黃酮含量測定 精密稱取山楂提取物0.1000 g，加無水乙醇溶解定容至100 mL，0.45 μm濾膜過濾待測。準確移取濾液2.00 mL，按照2.2.1方法顯色，得供試品溶液，在507 nm波長處測定其吸光度，依據(jù)回歸方程計算黃酮含量。

2.2.3 方法學(xué)考察 精密度試驗: 取同一蘆丁標準溶液，于507 nm處測定吸光度，平行6次，結(jié)果平均吸光度為0.264，RSD為0.47%( n =6)，說明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗: 取一份供試品溶液，于507 nm處測定吸光度，然后放置2、4、6、8、10 h分別測定吸光度，平均值0.374，RSD為0.83%(n=6)，說明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取山楂提取物0.1000 g 5份，按照2.2.2方法處理并測定吸光度，計算黃酮含量，黃酮平均含量26.13 mg·g-1，RSD為1.02%(n=5)，說明方法重復(fù)性良好。

回收率試驗: 取已知含量山楂提取物，加入蘆丁標準品適量，按照供試品溶液制備方法制備測定吸光度，計算回收率。結(jié)果回收率平均值為100.2%，RSD為1.02%(n=5)，說明該方法回收率良好。

2.3 山楂黃酮提取工藝優(yōu)化

山楂黃酮提取采用濁點萃取法，通過單因素實驗篩選，考察液固比(A)、萃取時間(B)、鹽溶液離子強度(C)、聚氧乙烯脂肪醇醚濃度(D)對提取率的影響，通過單因素實驗，設(shè)計4因素3水平表，見表1。利用Design expert 8.0軟件試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。以山楂黃酮提取率為響應(yīng)值，使用Design expert 8.0對結(jié)果進行多元回歸分析，結(jié)果見表3。

表1 濁點萃取4因素3水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸分析的結(jié)果

由響應(yīng)面分析可知，回歸方程為：Y=2.62+0.27A+0.18B+0.0.18C+0.073D+0.0657AB+0.045AC-0.055AD-0.028BC+0.058CD-0.28A2-0.23B2-0.16C2-0.13D2?；貧w模型P=0.0001<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，四個因素對山楂黃酮提取率影響大小為：考察液固比>萃取時間>鹽溶液離子強度>聚氧乙烯脂肪醇醚濃度，AB交互效應(yīng)最顯著,BC交互最弱。

圖2 液固比與萃取時間對提取率的影響

圖3 液固比與萃取時間對提取率的影響

圖4 液固比與萃取時間對提取率的影響

圖5 液固比與萃取時間對提取率的影響

圖6 液固比與萃取時間對提取率的影響

通過Design expert 8.0的處理，得到各因素對提取率的響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖1～6所示。預(yù)測山楂黃酮的最佳提取工藝為：液料比 87.32∶1，萃取時間30.68 min，鹽溶液離子強度3.45 mol·L-1、聚氧乙烯脂肪醇醚濃度34.2 g·L-1，提取率為2.72%。

2.4 最佳工藝驗證

根據(jù)響應(yīng)面軟件Design expert8.0預(yù)測的最佳提取工藝，為了便于實際實驗，將預(yù)測工藝修正為液料比 90∶1、萃取時間30 min、鹽溶液離子強度3.50 mol·L-1、聚氧乙烯脂肪醇醚濃度35 g·L-1進行試驗，結(jié)果山楂黃酮提取率為2.66%，與預(yù)測值2.72%接近。

2.5 不同炮制方法對山楂黃酮含量影響

取炒山楂、焦山楂、山楂炭和生山楂烘干去籽粉碎，按照2.1和2.2方法處理計算黃酮含量，結(jié)果見表4。

表4 不同炮制山楂黃酮含量比較

3 討論

濁點萃取是利用濁點原理和表面活性劑的增溶作用對待分離組分進行富集的一種新型萃取技術(shù)，利用表面活性劑在水相中形成膠束可以增加待分離組分溶解度，繼而改變實驗參數(shù)引發(fā)相分離，達到對待測組分分離的目的。筆者實驗通過濁點萃取法提取山楂黃酮，通過響應(yīng)面軟件Design expert8.0優(yōu)化，提取工藝最終提取率達為2.66%，并且發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)離子強度或者改變表面活性劑濃度等均可以提高提取率。濁點萃取法由于不使用有機溶劑，具有綠色環(huán)保，成本低廉的特點，有可能成為未來中藥有效成分提取的綠色新工藝。