百香果莖基腐病菌分離鑒定與藥劑篩選研究

鄺瑞彬，楊 護，楊 敏，周陳平，黃炳雄，魏岳榮

（廣東省農業科學院果樹研究所/農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣州510640）

0 引言

百香果屬于西番蓮科西番蓮屬的多年生常綠攀緣木質藤本植物，原產于巴西、巴拉圭至阿根廷等南美洲國家，果汁酸甜，營養豐富，風味獨特，集食用、觀賞及藥用價值于一身，具有十分廣闊的市場前景[1-4]。中國百香果自20世紀80年代初開始人工引種栽培以來不斷引種馴化和雜交選育，2019年初在廣東、福建、廣西、云南等各栽培區迅猛發展近3.3萬hm2，產量約達100萬t[5-6]。但是，近年來百香果莖基腐病發生嚴重，已成為百香果產業發展的主要限制因素，南方產區春夏雨季（5—8月）尤其多發，病重果園植株發病率達30%～40%，死亡率高達40%～60%。國內百香果果園大部分以價廉的帶土杯裝扦插苗為主，存在帶病土傳播的風險，使莖基腐病逐步蔓延傳播至廣東、廣西、福建等百香果主產區，造成嚴重經濟損失[6-7]。百香果莖基腐病報道始于20世紀80年代末，病癥多發生在植株距離地面5～15 cm的莖基部，幼苗階段百香果感染后，莖基部會出現深褐色斑狀，莖基皮層會逐步變軟進而腐爛、產生褐腐，其葉片發生萎蔫、黃化及脫落的情況，慢慢枝蔓枯萎乃至植株枯死[8-10]。早在20世紀90年代，李德富等[11]和鄭加協等[12]從百香果病株分離鑒定其病原菌為土傳真菌腐皮鐮刀菌(Fusarium sloani)和尖鐮孢(Fusarium oxyporum)，兩者都是根據傳統菌株形態觀察鑒定。菌株形態觀察鑒定的方法存在一定的主觀性。近年來的百香果相關研究主要集中在其莖基腐病的田間病癥、防治栽培及技術研究方面[13-14]；國外學者在巴西、南印度等地亦陸續分離并鑒定了侵染百香果的鐮刀菌，與國內研究結果較為一致，但對病菌致病性檢測和防治等缺乏后續報道[15-16]。采用傳統形態學與分子生物學技術[7,17-18]，在病原菌侵染早期進行準確、快速科學鑒定百香果莖基腐病致病真菌，開展病菌致病性研究，采取針對性的防控措施，可有效防止病情蔓延，減少生產損失。

本研究在廣東省百香果主產區采集莖基腐病病株，結合形態學觀察與分子測序方法鑒定分離病原菌菌株，并對菌株進行致病性檢測，同時檢測系列化學殺菌劑對病菌生長、形態及其致病性的影響，以期為后續百香果莖基腐病菌致病機理、百香果抗病育種等研究提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 百香果莖基腐病病原菌分離與培養

根據百香果莖基腐病典型病癥，在廣東省廣州、云浮、肇慶、茂名、河源等百香果產區田間采集百香果莖基腐病感染植株10個。參考Bueno等[16]的病原菌分離方法，各病樣取約6 cm病健交接處部位，在超凈工作臺依次用70%酒精和0.5%次氯酸鈉消毒，無菌水清洗。切取病部置于無菌馬鈴薯固體培養基(PDA)上，28℃培養箱暗培養5～8天。經2～3次培養，純化后最終獲得了8個病原菌真菌菌株，置于4℃下儲藏備用。

1.2 病原菌形態觀察與分子檢測

經單胞純化的病原菌菌株，分別置于馬鈴薯固體培養基(PDA)和康乃馨葉汁固體培養液(CLA)各自暗培養6天，記錄菌落顏色、形態及生長情況，用光學顯微鏡觀察病原菌的菌絲、分生孢子及厚垣孢子等形態，初步鑒定百香果莖基腐病病原菌的種[19-20]。在形態學特征鑒定的基礎上對分離菌株進行分子測序鑒定。接種待測菌株馬鈴薯液體培養基(PD)震蕩培養3～5天，采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，北京）提取病原菌的DNA。利用對分離菌株的核糖體基因內轉錄間隔區域（rDNA-ITS區域）和鐮刀菌特異性引物翻譯延長因子1α基因（EF-1α序列）進行PCR擴增，產物回收純化及測序。將獲得的rDNA-ITS區域和EF-1α序列與GENBANK數據庫(NCBI BlastN)進行相應序列的同源性比較分析，并選取數據庫中已知種名的近源鐮刀菌序列，利用DNAMAN和MEGA6.0軟件用鄰接法構建系統發育進化 樹 。ITS1(5’-3’)：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；EF-1αF(5’-3’)：CGCCTTGCTATTCCACAT，EF-1αR：CAACATACCA ATGACGGTGA。PCR反應體系25.0 μL：DNA模板1.0 μL，2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序：95℃預變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，進行35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR引物合成及PCR產物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 病原菌致病性檢測

按照柯赫氏法則進行病原菌的致病性測定。在離體致病性檢測實驗中，以‘臺農1號’、‘黃金果’2個主栽且易感病品種的百香果為材料，選取苗期植株勻稱的枝條，每個處理取枝條3支，每支剪取約6 cm莖段6個，用70%酒精進行表面消毒，放置于無菌培養皿中，干凈刀片輕刮表皮，放置均勻菌塊在傷口處進行接種[7]。不接種為對照，8個病原菌株系(FP1～FP8)，共9個處理，每個處理設3個重復，每個重復6個莖段。將樣品置于恒溫培養箱，28℃暗培養，每天觀察記錄，共觀察6天。根據莖稈感染程度劃分病情等級為5級。0級，莖稈無明顯侵染；1級，莖稈傷口處開始發生少量褐化；2級，傷口處褐化加重，向傷口兩側滲透約1 cm；3級，傷口處褐化面積擴大約1.5 cm，可見明顯白色菌絲生長；4級，傷口處褐化面積擴大約2 cm，白色菌絲生長較旺盛；5級，傷口處變褐潰爛，褐化面積擴大約3 cm，白色菌絲生長旺盛。在活體檢測分離菌株致病性實驗中，參考Silva等[21]的方法，培育健康粗壯的百香果扦插苗為植物材料，配制PD培養液，培養菌液3～4天，將孢子濃度調整至106孢子/mL；對百香果扦插苗采用傷口接種法進行接種，清水為對照，3個重復，每個重復為10株。接種后常規管理，20～40天后觀察植株病情，根據果苗病癥記錄發病情況，計算發病率，如式(1)。切取果苗發病株的感病莖基部組織，同上述分離純化，采用形態觀察法和分子鑒定進行再次確認。

1.4 不同殺菌劑對病原菌生長、形態和致病性的影響

選取常規殺菌劑8種（99%惡霉靈、45%咪鮮胺、80%烯酰嗎啉、33%春雷王銅、30%苯甲嘧菌酯、60%霜脲嘧菌酯、12%甲密甲霜靈、24%噻呋酰胺），無菌水配制好母液，按照實驗設計稀釋成設定目標濃度10倍的藥劑濃度備用，用0.45 μm過濾后，按比例加入約40℃PDA混勻制成測試平板。直徑8 mm均勻菌塊(strain FP6)接種到每個平板中央放置，28℃暗培養8天，每2天記錄生長情況。以常規PDA為對照，共9個處理，每個處理3個重復，采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算抑菌率[21]，如式(2)。在離體實驗中，選取成熟勻稱的百香果枝條，剪取約6 cm莖段，70%酒精進行表面消毒，放置于無菌培養皿中，無菌刀片輕刮表皮，再用設定濃度的殺菌劑噴灑表面，風干后放置均勻菌塊在傷口處進行接種。不接種和無菌水處理為對照，共10個處理，每個處理設3個重復，每個重復6個莖段。將樣品置于植物恒溫培養箱(28℃)，每2天觀察記錄，共觀察6天，記錄處理莖段的病菌侵染情況（同1.3）。

1.5 數據處理

采用Excel 2007軟件對實驗數據進行處理，SPSS 19.0軟件對實驗數據進行顯著性分析，采用Duncan新復極差法分析顯著性水平，P＜0.05差異顯著。

2 結果與分析

2.1 百香果莖基腐病病原菌分離及鑒定

2.1.1 百香果莖基腐病田間癥狀 百香果莖基腐病多發生在高溫多雨季節的陰蔽果園，主要從根、莖基部傷口入侵，病癥多發生于距離地面5～15 cm的莖基部位置。受感染的百香果莖基部初期會出現斑塊狀褐色或深褐色部分，逐步地其莖基表皮層就會變軟，產生褐腐，陰濕病園病株莖基部常見灰白色菌物，并產生腐爛霉臭味道，病株莖部表面橫切面木質部可見褐黃至褐色病斑；其上部葉片逐步發生萎蔫、黃化及脫落的情況，幼果發生萎縮和落果的現象，枝蔓逐漸枯萎乃至植株枯亡（圖1）。

圖1 百香果莖基腐病感染病癥

2.1.2 百香果莖基腐病原菌形態特征 在廣東省百香果主產區采集染病樣品10個，利用PDA培養基進行分離培養，純化獲得8個真菌菌株，并利用光學顯微鏡觀察形態特征。結果顯示，在PDA培養基多產孢子，CLA培養基則可觀察到分離菌的不同生長形態，如菌絲、分生孢子及厚垣孢子等。在PDA培養基中，不同的菌株樣品中，鐮刀菌形態略有差異（表1）。一般來說，分離菌落為氣生菌絲薄絨狀，呈白色、米白色或淺粉紅色，大型分生孢子為鐮刀型，一般為2～4個隔，大小為(45.3～185.2)μm×(12.1～18.5)μm，小孢子多為橢圓或長卵形，大小為(25.5～65.7)μm×(7.2～11.5)μm。各分離菌株呈典型的鐮刀菌真菌分生孢子，初步判斷為鐮刀菌真菌引起的病害（圖2）。

圖2 百香果莖基腐病原菌形態特征

表1 百香果莖基腐病原菌菌株形態

2.1.3 百香果莖基腐病原菌株分子鑒定 利用通用引物ITS1/ITS4可擴增獲得長度為537～567 bp的片段。將測序所得序列進行BLAST在線比對分析，發現其中分離獲得的8個菌株(FP1～FP8)的rDNA ITS序列與NCBI數據庫中多個腐皮鐮刀菌菌株對應序列(Fusarium solani)（登錄號 MK734064.1、KY978584.1、MK734064.1、MH160786.1、MF782768.1等）的相似性高達100%（圖3）。根據鐮刀菌特異性引物翻譯延長因子1α基因（EF-1α序列）進行PCR擴增，將測序所得序列進行對比分析，基于EF-1α序列相似性構建的系統發育進化樹，結果顯示，百香果莖基腐病菌菌株FP1～FP8與腐皮鐮刀菌(F.solani)的多個分離物聚為一個分支，以上菌株與尖孢鐮刀菌(F.oxyporum)菌株、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)菌株及輪狀鐮刀菌(F.verticillioids)分屬不同鐮刀菌分支（圖4）。通過形態特征觀察、分子生物學鑒定，分離獲得的百香果莖基腐病菌鑒定為腐皮鐮刀菌(F.solani)。

圖3 百香果莖基腐病原菌菌株基于ITS和EF-1a的PCR分子檢測

圖4 百香果莖基腐病原菌菌株基于EF-1a序列相似性構建的鐮刀菌系統發育進化樹

2.2 百香果莖基腐病原菌致病性檢測

百香果致病性檢測實驗采用離體及活體檢測2個方法。菌株離體接種致病性測定結果顯示，2個易感病品種（‘臺農1號’(TN)，‘黃金果’(HJG)）接種1～2天后，接種部位開始出現淺褐色病斑；第3天后，病斑沿莖段呈條形擴展，呈褐色水漬狀；第4天起，部分莖段枝條水漬腐爛，白色菌絲明顯（圖5）。根據莖稈受菌株感染程度劃分為5級，第6天統計結果顯示，不同菌株在2個感病品種致病力反應基本一致，在‘黃金果’中比‘臺農1號’致病力更高。不同菌株致病性能力有差異，其中FP2、FP3、FP6和FP7的致病力較高?；铙w接種致病性測試結果顯示，接種2周后接種部位開始出現淺褐色或褐色病斑；接種30天后病斑逐步變大，莖基部變褐，植株葉片開始皺縮萎蔫；接種40天后，病株葉片凋落，部分植株枯黃甚至死亡（圖6）。菌株致病力在‘黃金果’中發病率高達50%以上，在‘臺農1號’略低，發病率為10%～60%不等。FP6在‘臺農1號’中發病率為最高為60%，在‘黃金果’中達90%，所以其致病力為最高。病菌致病力測試中，離體和活體實驗結果較為一致，綜合兩者，篩選出致病力較高的菌株為FP6、FP7、FP2，其次為 FP1、FP3、FP8和 FP4，最低為FP5。以上植株發病后從病斑上再次分離，獲得與接種病原菌相同的分離菌株。

圖5 百香果莖基腐病原菌菌株致病性測試（離體實驗）

圖6 百香果莖基腐病原菌菌株致病性測試（活體實驗）

2.3 不同殺菌劑對病菌生長形態及其致病性的影響

為探究防治百香果莖基腐病菌，以8種常規殺菌藥劑為材料（表2），研究其對病菌(FP6)的生長及形態等影響，并在離體實驗中觀察不同藥劑處理對接種病菌的抑制效果。結果顯示，T2對病菌生長抑制力顯著高于其他藥劑處理(95.56%)，其次為T5、T6和T7，抑制率最低為T1和T8（表2）。在離體實驗中，百香果莖段經殺菌劑處理后，在傷口處進行接種。結果顯示，不同藥劑處理后，T5處理后的病情等級最低，其抑制效果最佳，T2、T6、T7略遜色；T8、T4在早期有抑菌作用，但后期抑菌力較差；T1、T3抑菌效果最差。離體檢測與處理菌株生長形態的結果基本相符。建議栽培中避免長期、單一使用內吸性殺菌劑，優先選用殺菌劑苯甲嘧菌酯，適當利用咪鮮胺、春雷王銅、霜脲嘧菌酯、甲密甲霜靈等混用或輪用，可有效治理百香果莖基腐病害。

表2 不同藥劑對菌株生長及致病力的影響

3 結論與討論

3.1 百香果莖基腐病菌鑒定與致病性

引起植物枯萎?。S萎病、莖腐病等）的土傳真菌鐮刀菌屬大約由70個種組成，其中主要包括茄腐皮鐮刀菌(F.solani)、尖鐮孢菌(F.oxyporum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、輪狀鐮刀菌(F.verticillioides)等，主要的致病真菌毒素包括鐮刀菌酸、白僵菌素、毛霉烯、伏馬菌素等；其主要危害包括植物致病性造成產量損失，產生真菌毒素污染及對人類和牲畜的健康造成影響[22-24]。百香果莖基腐病屬土壤鐮刀菌真菌引起的病害，在南美巴西、非洲、澳大利亞及韓國等東南亞國家與中國主產區如廣東、廣西、福建及海南等地均有報道，發病時間集中多在春夏多雨季節，傳播速度快，防治困難，導致果園產量驟減，經濟效益嚴重受損[6-7,13,15]。李德富等和鄭加協等[11-12]根據傳統菌株形態觀察鑒定其病原菌為腐皮鐮刀菌(F.sloani)、尖孢鐮刀菌(F.oxyporum)；近年發展的分子測序手段在鐮孢霉屬真菌等真菌生物鑒定應用上，大大提高了鑒定的準確性和科學效率[18,24]。宋曉兵等[7]利用病原菌形態特征觀察和分子生物學鑒定測定，確定廣東西番蓮莖基腐病原菌為腐皮鐮孢菌(F.solani)，但是只有一個樣本數量，尚欠缺代表性。本研究在廣東省百香果主產區田間采集莖基腐病病株樣品10個，成功分離純化獲得8個真菌菌株，經形態學觀察法與分子鑒定方法對菌株鑒定，確定分離獲得的百香果莖基腐病菌鑒定為腐皮鐮孢菌(F.solani)，與前人研究較為一致，與宋曉兵等結果相比更具代表性[7,11-12]。經離體與活體實驗，對不同菌株進行了致病力測試，篩選了致病性較強的3個菌株，為進一步研究莖基腐病致病機理、防治措施和抗性育種等提供了材料基礎。本研究較為科學、全面地了解廣東省百香果產區莖基腐病的致病菌情況，為進行百香果莖基腐病原菌早期鑒定及致病機理研究，開展針對性防控措施及抗性育種等研究提供材料和技術基礎。

3.2 百香果莖基腐病的防治

百香果莖基腐病是百香果產業發展的重大威脅，多雨季節常見于扦插苗幼苗期或2年期老苗植株，其傳染性強，主要通過流通帶土病苗、雨水、農田灌溉、農耕工具、昆蟲咬食等途徑傳播，嚴重時田園植株枯黃死亡，顆粒無收。鐮刀菌真菌病害防治實踐中目前依賴于化學殺菌劑，如70%甲基托布津涂抹法、50%多菌靈可濕性粉劑、60%代森鋅等均有一定效果[13,26]。在本實驗中，選取了8個殺菌藥劑，研究不同藥劑處理對菌株生長及致病力的影響，實驗結果顯示，30%苯甲嘧菌酯（1500倍）的抑制效果為最佳，其次為咪鮮胺、霜脲嘧菌酯、春雷王銅、甲密甲霜靈。初步田間實驗結果顯示，避免單一藥劑施用，采用幾種藥劑混用或輪用，可有效治理百香果莖基腐病害。本實驗結果是前人報道的有效補充，可為后續莖基腐病綜合防治提供理論基礎。

為了百香果產業的可持續發展，建議百香果莖基腐病防治采用綜合防控手段。（1）防治應以預防為主，種植前選擇適宜低緩坡地，對土壤施用適量石灰或石硫合劑進行消毒，中和土壤酸度；增施腐熟有機肥和生物肥為底肥，增加有益菌群[27]。（2）建議選擇抗性砧木的健康嫁接苗，并減少帶土扦插苗傳播病害的風險。（3）適當選擇通風透光的搭架修剪模式，果園間作、輪作栽培。（4）及時疏通積水，建議地下水為水源的水肥灌溉措施。（5）均衡施肥，避免施用過量氮肥，花期及結果期適量補充鉀元素，提高抗逆性。（6）做好病源早期檢測與預防工作，利用70%甲基托布津、咪鮮胺、春雷王銅、苯甲嘧菌酯、霜脲嘧菌酯等化學藥劑進行早期防治，嚴重病株要及時銷毀并清理出園，并做好消毒工作。（7）開展抗病育種研究，利用傳統與分子育種手段創制抗病新種質，改變百香果品種單一的局面，利用種內生物多樣性控制病害[22,28]。

本研究利用形態學觀察與分子方法鑒定百香果莖基腐病菌，確定分離所得病原菌為腐皮鐮刀菌(F.solani)；并對不同病原菌菌株的致病力進行了測試篩選，在此基礎上，利用不同藥劑進行處理，研究其對病原菌的生長及致病力的影響。本研究較為科學、全面地了解了廣東省百香果產區莖基腐病的致病菌情況，且篩選了效果較佳的防治藥劑，有效防止莖基腐病情蔓延傳播。不足之處在于，試驗中致病菌均采集于廣東省百香果主產區，其他產區如廣西、福建、云南等地的百香果菌株未涉及，所以數據結果未必適用于國內其他產區，在進一步研究中，將擴大樣品采集范圍，開展百香果莖基腐病病理學及綜合防控等相關研究，為解決百香果產業的關鍵技術難題提供基礎。