手性差異對水產養殖沉積物環境中農藥氰戊菊酯降解的影響

宋 超，鄒劍敏，汪 倩，陳 曦，方龍香，裘麗萍，陳家長

（1中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇無錫214081；2農業農村部水產品質量安全環境因子風險評估實驗室（無錫），江蘇無錫214081；3農業農村部水產品質量安全控制重點實驗室，北京100000）

0 引言

底泥是水產養殖環境不可忽略的一部分，既是水體營養的沉積地，也是環境污染物的蓄積場所[1]。底泥生態環境中的物質循環不僅影響著底棲生物的生存，也關系著整個水體的物質和能量平衡。隨著工業的發展，有機污染物在水生態底泥環境中的不斷富集，必然會威脅整個養殖環境。近年來，擬除蟲菊酯不斷被應用于農業和衛生安全等領域[2]，氰戊菊酯(fenvalerate，FV)作為常用的擬除蟲菊酯類農藥，自然成了底泥污染物中常見的一類，其在水產養殖底泥環境中也開始被頻繁檢出[3-4]。徐春娟[5]在四川的一些養殖水體中發現FV殘留的存在，Wang等[6]在沉積物中發現了FV的普遍存在。FV在環境中的生態毒性已經被學者們廣泛研究，其對養殖產品和其他水體生物存在較高的毒性作用[7-9]。然而，FV在底泥環境中到底存在著怎樣的降解規律，并沒有研究進行探究。FV在底泥中的降解轉化將直接決定水體生物的安全，在養殖環境中，甚至會間接影響養殖產品的質量安全。陳莉等[10]研究了FV在不同土壤環境中的降解趨勢，并發現其在土壤中的半衰期長達17.7～25.3天之久。底泥作為類似的復雜環境，FV的降解趨勢需要進行進一步探究。

另外，FV的4種手性異構體在環境中的生態毒性具有較大的差異[11]，其在底泥環境中的降解差異并沒有學者進行詳細闡述。為探究FV及其不同異構體在養殖底泥環境中的降解消除規律，本研究以池塘底泥為試驗對象，觀察不同添加濃度和不同異構體的FV在底泥中的降解情況，以期為養殖池塘底泥中FV殘留的去除及環境監測工作提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用FV標準品（4種手性異構體混合物，純度>95%）購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，FV乳油（純度95%）購自湖北安博共創科技有限公司。FV的4種手性異構體分別為αR-2S-FV(FV1)、αS-2R-FV(FV2)、αR-2R-FV(FV3)和αS-2S-FV(FV4)，其中FV1和FV2為反式異構體，FV3和FV4為順式異構體，這4種異構體均由95%FV乳油分離純化得到[12]。所用丙酮和正己烷為色譜純溶劑，均購買于德國默克試劑生物科技公司。標準品溶于丙酮，在-20℃的條件下儲存備用。

底泥樣品材料于2018年5月23日采自揚州江都市吳堡縣羅氏沼蝦養殖塘（取表層1～10 cm底泥）[13]。采樣池塘的主要水質指標和底泥相關指標詳見表1和表2。試驗開始前對底泥樣品中擬除蟲菊酯類農藥殘留情況進行排查，采用1.3的檢測方法，確保所選底泥樣品沒有常規的擬除蟲菊酯類農藥殘留。

表1 采樣池塘底泥的理化指標

表2 采樣池塘水的理化指標

1.2 試驗設計

配制濃度分別為10、100 mg/L的FV、αS-2S-FV、αR-2S-FV、α-2R-FV和αR-2R-FV 5種儲備溶液，溶于丙酮。取經過滅菌的500 mL三角瓶30個，分為10組，每組設置3個平行。第1～5組為低濃度組，6～10組為高濃度組，每組中均加入330 g底泥，具體試驗分組設計如表3。

表3 試驗設計分組方案

三角瓶用紗布封口，在生化培養箱中于25℃、黑暗條件下靜置培養。預培養1天后，在三角瓶中加入相應藥品，配制成濃度為20 μg/L和200 μg/L的底泥樣品。低濃度設定值參考趙晨等[14]在底泥環境中的檢測結果（平均濃度21.8 μg/L），高濃度值依據環境檢出濃度的10倍設定。培養過程中定期補充蒸餾水（補水量=前次采樣后樣品瓶總重-當次采樣前樣品總重）。分別在加藥培養的第0、7、14、21、28天采取15 g左右底泥于50 mL離心管中，用于監測樣品瓶中添加FV及其異構體的濃度變化和異構體轉化情況。試驗所用FV（混標）的4種手性異構體占比情況根據張敬衛等[15]手性異構體的分離方法測定。

1.3 氰戊菊酯檢測

1.3.1 樣品前處理 稱取5 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入2 g銅粉后震蕩0.5 min，再加入20 mL正己烷/丙酮(1:1，V/V)混合液。在2000 r/min條件下震蕩渦旋5 min，超聲10 min。將樣品放入冷凍離心機中，在8000 r/min條件下離心5 min。離心結束后，轉移上層有機相至氮吹管中，并在40℃水浴條件下用氮氣吹干。用1 mL正己烷/丙酮(6:1，V/V)混合液復溶，使濃縮液通過已活化的GCB+Florisil固相萃取柱（用10 mL正己烷活化），再用6 mL正己烷/丙酮(6:1，V/V)混合溶液分3次潤洗氮吹管，并作為洗脫液洗脫萃取柱。用氮吹管收集濾過液及洗脫液，在40℃水浴條件下用氮氣吹干，用1 mL正己烷定容。經0.22 μm的有機相濾器過濾，轉移至進樣瓶中，待上機測定。

1.3.2 樣品檢測 Agilent-7890A氣相色譜儀；色譜柱：DB-5毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；檢測條件：載氣為高純氮氣；線速度30 cm/s；進樣方式我脈沖不分流，脈沖壓力40 psi，截止時間0.5 min；進樣口溫度 260℃；進樣量 1 μL；ECD 檢測器；檢測器溫度310℃；尾氣為氮氣；尾吹30 mL/min；升溫程序：100℃，保持1 min，以30℃/min升至250℃，再以20℃/min，升至290℃，保持8 min。

1.3.3 樣品定量 在10～500 μg/L范圍內配制梯度標準溶液。采用外標法色譜結果進行定量計算，在對不同色譜峰對應的響應面積分別進行定量計算不同異構體濃度。以10倍信噪比作為定量限，該方法定量限為1 μg/L，加標回收率范圍在80.70%～94.65%，平均值為87.17%。

1.4 數據分析

根據氣相色譜定量得出水中藥物濃度后，通過一級反應動力學方程進行擬合，方程如(1)所示[16]。

其中，Ct表示藥物在時間t的濃度，C0為藥物初始濃度，t為持續時間，k為消除速率常數，并通過式(2)計算半衰期。

所有數據利用Excel進行處理，樣本間FV降解半衰期差異通過SPSS 19.0軟件進行ANOVA分析(P<0.05)，在95%置信水平下(α=0.05)進行差異檢驗。小寫和大寫字母分別表示高和低濃度組FV及其手性異構體間的多重比較結果，如果兩組間有相同字母，則表示不顯著，反之顯著。

2 結果與分析

利用液相手性分離方法，發現試驗所用FV中的4種手性異構體FV1、FV2、FV3和FV4的所占比例分別為25.13%、28.27%、21.92%和24.69%。順式對映體部分所占比例低于反式對映體比例（表4）。

表4 氰戊菊酯在液相色譜中的手性分離結果

當轉化進行3周后，轉化速率變慢，轉化產物變化開始不斷減少。對FV的濃度數據進行擬合，得到的各個方程均有較高的相關性系數（表5）。擬合結果表明，FV的降解過程符合一級降解動力學，初始濃度并不影響FV的降解趨勢。FV及其手性異構體在底泥環境中的半衰期如圖1所示。高濃度組，FV、FV1、FV2、FV3、FV4的半衰期分別為(26.77±1.67)、(36.15±3.34)、(19.45±0.50)、(31.05±0.65)、(23.19±2.80)天。低濃度組，FV、FV1、FV2、FV3、FV4的半衰期分別為(28.97±1.63)、(38.73±2.88)、(19.47±0.91)、(32.05±1.35)、(24.51±1.06)天。高、低濃度組間FV及其手性異構體的半衰期沒有顯著差別，表現基本一致，從大到小依次是FV1＞FV3＞FV＞FV4＞FV2。根據統計性檢驗分析，高、低濃度組，FV1的降解半衰期顯著高于其他異構體，FV3顯著高于FV2和FV4。

圖1 底泥樣本中氰戊菊酯及其手性異構體的半衰期

表5 氰戊菊酯的降解動力學方程

FV存在4種不同的手性異構體，但在氣相色譜儀器中常以順式和反式對映體2種形式出峰。不同手性異構體在環境中的轉化形式如圖2所示[17-18]，FV2與FV3之間會發生互相轉化，FV1與FV4之間會發生互相轉化，均在α-C位置發生異構。所以當單個手性異構體在環境中進行異構體轉化時，在色譜峰圖上其相對應的對映體峰位置會有新的峰出現。本研究結果發現高濃度組和低濃度組均存在不同程度的異構體轉化，圖3和圖4中每條曲線為該FV手性異構體對應的在α-C位置異構的手性異構體的干重濃度變化。低濃度和高濃度處理組中的4種手性異構體呈現一致的轉化趨勢，在培養的第1周之后手性異構體的轉化速率開始加快，第3周達到轉化的峰值，之后轉化速率便開始顯著下降。

圖2 氰戊菊酯氣相色譜圖及其異構體轉化規律

圖3 低濃度組氰戊菊酯各手性異構體的轉換情況

圖4 高濃度組氰戊菊酯各手性異構體的轉化情況

3 結論

研究發現，FV在底泥環境中的降解過程符合一級降解動力學方程。不同暴露濃度條件下，FV及其手性異構體的降解半衰期無顯著性差異。FV在底泥環境中有較長的降解周期，其降解半衰期范圍是19.47～38.73天。FV的不同手性異構體在底泥環境中的降解半衰期存在一定差異，在漁業環境監測時需要分開進行。FV在底泥環境中存在α-C位置異構現象，當轉化進行一定時間后，轉化產物開始不斷減少。

4 討論

本研究利用FV的液相手性分離方法發現FV中的4種手性異構體的含量所占比例較為相近，按大小順序依次是FV2＞FV1＞FV4＞FV3。整體來看，順式對映體部分所占比例低于反式對映體比例。FV的降解過程為一級反應，即FV在底泥環境中有著固定的降解趨勢，但高濃度FV的降解速率會顯著高于低濃度FV。其原因或許與底泥中微生物群落的反饋作用有關，高濃度FV對微生物群落造成了較顯著的影響，使得環境中產生可利用FV的優勢種群。Birolli等[19]曾在土壤中分離得到可以加速FV在土壤中降解的菌株。本課題在水體FV降解規律的研究中同樣發現微生物對FV降解所起到的重要作用。

根據FV中手性異構體組成比例的不同和其不同手性異構體在底泥環境中的降解半衰期結果，可以計算得出FV在底泥環境的降解半衰期范圍在19.47～38.73天之間。相比于Zhang等[20]在水環境中的研究結果（FV降解半衰期范圍在4.75～11.95天），本研究中FV在底泥中的降解速率較為緩慢。本研究試驗條件為25℃，高于一般底泥環境的溫度，可見FV在實際較低溫度環境中會更難以降解。Cotham等[21]發現在pH 7.3～7.7的海水/沉積物系統中，FV半衰期為12天，且存在由海水向沉積物中轉化的情況。有研究發現，pH增大會提高FV在沉積物中的溶解度[22]。因此，FV在進入水產養殖環境后更易在底泥中長時間蓄積，且對底泥環境存在較大的威脅。所以，在對水產養殖池塘清塘時應盡量避免使用FV清除野雜魚和甲殼類水生生物，以免造成FV的殘留。

另一方面，FV不同異構體在底泥環境中的降解差異需要引起重視。不同異構體間，FV2在底泥環境中降解最快，其次是FV4、FV3和FV1。Corcellas等[23]發現，擬除蟲菊酯的環境殘留中順式異構體比例比反式異構體更高。趙晨等[14]發現太湖和巢湖的底泥沉積物中存在較高濃度的高效FV殘留。本研究并沒有發現順式對映體和反式對映體在半衰期上的顯著性差異，環境中順式對映體富集較高與高效氰戊菊酯的大量使用存在一定的關系[11]。由于順式異構體在環境中有較高的生態毒性[24]，順式FV在環境中的生態危害大于反式FV。目前對于FV的生態監測多是檢測FV的殘留，所以對FV不同異構體分開進行監測和風險評估尤為重要。

不同異構體除了在降解上的差異之外，還會存在不同手性異構體之間的轉化。本研究結果與Liu等[17]的研究一致，FV同樣在α-C位置發生異構，進行順式和反式異構體之間的相互轉化。Li等[12]發現，αS,2SFV在向αR,2S-FV轉化時，當αR,2S-FV增加到一定濃度時便開始減少。本研究4種異構體均有著相同的趨勢，當FV在第3周轉化到最高值時也開始減少。這一結果說明FV不同異構體在降解的同時存在著手性異構的相互轉化，當轉化到一定程度時，轉化速率開始減慢，轉化產物同樣開始降解。隨著FV暴露時間的增長，FV在環境中主要存在的消除行為是化學降解，而不再進行手性異構體之間的相互轉化。一些學者發現，手性菊酯類農藥在極性溶劑和堿性條件下易存在α-C位置的手性異構[25-27]。所以，在進行環境監測時，FV樣品應在酸性條件下保存非極性溶劑中，確保結果的穩定性。在順式對映體殘留較高的環境中，可以通過提高環境pH的方式促進順式對映體的轉化，以降低FV的生態毒性。李邵彤[28]發現擬除蟲菊酯類農藥不同異構體的降解快慢不僅源于環境理化因素，還與微生物的活動密不可分。所以在促進高毒性和殘留濃度較高的異構體轉化時，可以考慮微生物的作用。