谷子抗咪唑啉酮的遺傳應用和基因初定位

宋 慧，王 濤，田禮新，張 揚，李 龍，邢 璐，劉金榮，馮佰利

（1安陽市農業科學院谷子研究所/河南省谷子育種工程技術研究中心，河南安陽455000；2安陽工學院生物與食品學院，河南安陽455000；3西北農林科技大學農學院，陜西楊凌712100）

0 引言

谷子具有節水抗旱、耐貧瘠、耐儲藏的特點，是C3模式作物，對中國農耕文化發展和現代農業科技有著重要作用[1-2]。近年來，隨著國家現代農業產業技術體系持續支持，科研單位聯合攻關，在抗除草劑品種培育、精播免間苗、全程機械化管理、品質提升、產業鏈延伸等領域取得突破性進展，谷子的種植方式也由單戶向產業化、規模化方向發展[3-6]。以河南省為例，2010—2018年，谷子種植面積由3.52萬hm2增長到4.89萬hm2，增幅達到34.4%，單產增加25.73%（數據來源于河南省種子管理站）；受谷子經濟效益的影響，全省谷子種植面積總體上呈穩中上升趨勢。但是，在雨熱同季的華北夏谷區，谷田雜草種類繁多，尤其谷田單子葉惡性雜草，苗期長相與谷苗相似，不易區別，不易剔除，往往造成減產20%～30%，嚴重制約谷子產業的發展[7-9]。

化學除草是谷田除草的主要方式和發展方向，目前谷子推廣的品種多為抗拿捕凈品種，需要2種除草劑配合使用才能徹底除草。咪唑啉酮類除草劑獨具兼殺單雙子葉雜草的優勢，可防除眾多的一年生和多年生禾本科雜草以及闊葉雜草、莎草科雜草等[10-11]。藥物通過根、莖、葉處理后，經由植株木質部和韌皮部傳導，作用于植物分生組織，產生抑制植物的乙酰乳酸合成酶，阻止支鏈氨基酸，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成，破壞蛋白質的合成，干擾DNA合成及細胞的分裂與生長，引起植株死亡[12-14]。抗性品種的選育有效地解決了田間谷子見苗和除草問題，降低勞動強度，節約勞動成本，推進了谷子輕簡化生產技術進程[15]。本研究團隊從河北省農林科學院谷子所引進抗咪唑啉酮除草劑的突變材料，經自交和回交得到一批抗咪唑啉酮類除草劑的育種材料。此材料對于抗咪唑啉酮類除草劑谷子品種的培育及谷子雜交種新型制種體系的構建都具有十分重要的意義。然而，關于谷子對咪唑啉酮抗性的來源和遺傳尚不清楚。本研究以抗性谷子品系‘安5158’和敏感性谷子品種‘豫谷9號’為試驗材料，通過抗性鑒定和抗性生理機制研究，分析谷子對除草劑產生敏感性的遺傳基礎，并對此敏感性基因進行初定位，旨在為開展谷子抗除草劑分子標記輔助選擇育種和轉基因育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

材料來源于安陽市農業科學院谷子研究所資源庫。抗咪唑啉酮谷子新品系‘安5158’由安陽市農業科學院谷子所利用常規有性雜交和回交方法將青狗尾草的抗咪唑啉酮基因轉移至栽培谷子中，創制出了抗咪唑啉酮谷子新種質，經過系統選育而成，各項性狀穩定。敏感型親本‘豫谷9號’植株經濟性狀和抗性性狀純合一致。咪唑啉酮類除草劑為德國巴斯夫公司生產的甲咪唑煙酸水劑。

1.2 試驗點自然概況

田間試驗在河南省北關區柏莊鎮安陽市農業科學院試驗基地進行，該區域位于太行山東南麓，黃河以北，114°37′E、36°18′N，屬暖溫帶氣候，海拔75 m，年平均氣溫13.6℃，年平均降水量606.1 mm，無霜期201天。供試土壤為黃壤土，土壤肥力中等，呈弱堿性(pH 7.64)，耕層土壤含有機質1.31%、全氮0.85 g/kg、有效氮54.6 μg/g、速效磷20.4 μg/g、速效鉀212 μg/g。

1.3 試驗設計

1.3.1 谷子萌發試驗 試驗于2017年5月在安陽市農業科學院實驗室進行。谷子種子發芽前用去離子水浮選去除癟粒，精選飽滿、大小一致的種子，用2%的雙氧水消毒10 min。在鋪有濾紙的培養皿（直徑15 cm）中，分別加入不同濃度(0、150、200、250、300、350、400、450、500 mL/hm2)的甲咪唑煙酸藥液，每個培養皿均勻擺放100粒抗性和敏感性的種子，每個處理3次重復，用雙層濾紙覆蓋，置于28℃的恒溫培養箱內（浙江拓普智能人工氣候箱RTOP-268D）培養，待發芽至第7天，統計不同處理的發芽情況，第15天調查種子存活粒數，計算存活率。

1.3.2 抗性效應試驗 試驗于2017年在安陽市農業科學院柏莊綜合試驗站進行。6月20日播種，待3葉1心期，噴施不同濃度甲咪唑煙酸進行抗性效應試驗。小區行長3 m，行距0.4 m，每小區6行；設置6個處理，用藥量分別為0、150、250、350、450、500 mL/hm2，以不抗咪唑啉酮類除草劑的品種‘豫谷9號’為對照，均勻噴灑至葉面。噴藥1、4、7天分別取樣，每個小區取6株倒二葉葉片，測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)生理指標。

1.3.3 咪唑啉酮抗性的遺傳試驗 2016年夏季將抗性材料‘安5158’和敏感材料‘豫谷9號’進行有性雜交，2016年在海南試驗基地鑒定F1和親本的抗性表現。2017年在夏季柏莊基地將F1與母本‘豫谷9號’進行回交獲得BC1群體，2018年夏季在柏莊基地鑒定BC1分離世代的抗性表現，統計分離比例，進行卡方測驗。親本及各遺傳世代在谷子3～5葉期用德國巴斯夫公司生產的甲咪唑煙酸水劑，處理濃度為250 mL/hm2，5天不抗除草劑材料開始出現表型，15天后調查成活苗與死苗數。

1.4 生理指標的測定

取谷子倒二葉葉片，測定葉片的生理生化指標。采用SOD試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供）測定SOD活性；采用POD試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供）測定POD的活性；采用CAT試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供）測定CAT的活性；采用BCA試劑盒（由南京建成生物工程研究所提供）測定MDA濃度。

1.5 數據統計與處理

數據采用SPSS v19.0進行顯著性分析，采用LSD方法進行多重比較(P＜0.05)，采用Origin 8進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度甲咪唑煙酸對谷子種子萌發的影響

由表1可知，用不同濃度的甲咪唑煙酸噴施抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號’種子，發芽率和存活率受抑制程度不同。抗性材料‘安5158’處理濃度為450 mL/hm2時，發芽率受顯著抑制，存活率為14%，處理濃度為500 mL/hm2時，發芽率7%，沒有存活的植株。在150 mL/hm2濃度下，敏感材料‘豫谷9號’發芽率和存活率大幅度降低；濃度為250 mL/hm2時，種子發芽后完全不能存活。由此可知，咪唑啉酮除草劑對谷子種子的萌發有一定的抑制作用，但抗性材料的種子發芽率和發芽后存活率受抑制作用影響較小。

2.2 不同濃度咪唑啉酮對谷子葉片生理指標的影響

由圖1中可知，噴施甲咪唑煙酸后，隨著噴藥時間的延長及甲咪唑煙酸處理濃度的逐漸增加，抗性和敏感性材料的SOD活性均呈下降趨勢。敏感性材料‘豫谷9號’，噴藥后1天SOD活性下降幅度較小，與對照處理相比無顯著差異；噴藥后4天和7天SOD活性大幅下降，與對照差異顯著，尤其噴施第7天在250 mL/hm2濃度下SOD活性的下降幅度最大。抗性材料‘安5158’，隨著噴藥處理時間延長，SOD活性呈逐漸降低，以450 mL/hm2濃度下SOD活性下降明顯。結果表明，抗性材料的SOD活性比較穩定，敏感性材料的SOD活性更易受除草劑影響。

圖1 不同濃度咪唑啉酮對谷子葉片SOD活性的影響

由圖2可知，噴施甲咪唑煙酸后，隨著噴藥時間的延長及甲咪唑煙酸處理濃度的增加，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號’的POD活性均呈下降趨勢，敏感性材料的POD活性下降幅度更為明顯。噴施甲咪唑煙酸后1天，抗性和敏感性材料的POD活性與對照相比均無顯著差異。噴藥后4天，敏感性材料‘豫谷9號’在250 mL/hm2濃度下POD活性與對照處理呈顯著差異；而抗性材料‘安5158’噴藥第7天在350 mL/hm2濃度下POD活性開始下降，450 mL/hm2濃度下POD活性急劇下降，與對照相比達到顯著水平。

圖2 不同濃度咪唑啉酮對谷子葉片POD活性的影響

由圖3可知，噴施甲咪唑煙酸后，隨著噴藥時間的延長及甲咪唑煙酸處理濃度的增加，抗性和敏感性材料的CAT活性均呈下降趨勢。噴藥后1天，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號’的CAT活性與對照相比均無顯著差異。噴藥后4天，抗性材料‘安5158’在250 mL/hm2濃度下CAT活性與對照相比下降了11.4%，達差異顯著水平，在250～350 mL/hm2濃度下CAT活性下降水平分別為40%和76.3%。噴藥后7天，敏感性材料‘豫谷9號’分別在450 mL/hm2和500 mL/hm2濃度下CAT活性與對照處理呈顯著差異(P＜0.05)。

圖3 不同濃度咪唑啉酮對谷子葉片CAT活性的影響

結果表明，抗性材料‘安5158’的CAT活性降低幅度明顯小于敏感性材料‘豫谷9號’，說明抗性材料‘安5158’CAT活性更為穩定，化解甲咪唑煙酸脅迫的能力更強。

從圖4可看出，隨著甲咪唑煙酸處理濃度的增加，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號’的MDA活性均呈上升趨勢。且對于抗性材料‘安5158’，噴藥第7天的450 mL/hm2的MDA活性急劇上升，與對照之間差異顯著，而敏感材料‘豫谷9號’在第4天和第7天的250 mL/hm2MDA活性遠遠高于第1天，尤其是隨著處理濃度的增加，升高幅度也急劇增大。說明敏感材料‘豫谷9號’的MDA活性對除草劑處理更加敏感。

圖4 不同濃度咪唑啉酮對谷子葉片MDA活性的影響

2.3 谷子抗性遺傳基礎鑒定

在對抗性材料‘安5158’及敏感性材料‘豫谷9號’噴施咪唑啉酮除草劑15天后，觀察材料抗性效果反應。結果顯示，抗性材料‘安5158’無藥害反應，敏感材料‘豫谷9號’5天左右表現出谷子幼苗心葉開始發黃，然后整株變黃，最后干枯死亡，BC1群體表現出50%左右的死亡率（圖5），經卡方檢驗，符合回交群體1:1的孟德爾遺傳比例，驗證了前人屬于單基因遺傳的結論（表2）。

表2 抗性和敏感材料噴施甲咪唑煙酸后的調查結果

圖5 抗性和敏感親本及BC1群體噴施甲咪唑煙酸后15天的生長狀態

2.4 谷子抗咪唑啉酮敏感性基因初定位

通過構建F2:3家系抗、感池，及噴施除草劑前、噴施除草劑后的混池，進行BSR-Seq分析，共得到79521個關聯SNP，其中位于谷子1號染色體上的SNP有929個，占比15.06%，噴施除草劑前抗、感池中共得到930個關聯SNP，其中位于谷子1號染色體上的SNP有537個，占比57.74%，噴施除草劑后抗、感池中共得到1243個關聯SNP，其中位于谷子1號染色體上的SNP有640個，占比51.49%（圖6）。可知，與甲醚煙酸抗性相關的SNP位點富集在1號染色體短臂上。結合滑動窗口法將對甲咪唑煙酸敏感性基因初步定位在第1染色體短臂上6.8～30.8 Mb之間，區間大小為24 Mb（圖7）。通過對差異表達基因做進一步分析，發現噴施除草劑前后共鑒定出132個差異表達基因，其中有9個基因位于初定位區間內。

圖6 咪唑啉酮抗性基因相關的SNPs位點在染色體上的分布

圖7 利用BSR-seq分析谷子與甲醚煙酸抗性相關基因的定位

3 討論

農作物能夠進行正常生長發育的前提要素是保證種子可以萌發，萌發期也是對外界環境的變化最為敏感的生育時期。除草劑的不規范使用劑量可以造成除草劑在土壤中的殘留，對種子的萌發會產生嚴重的影響。王倩等[16]對241份甘藍型油菜種子進行25 mg/kg苯磺隆處理，綜合分析得出，25 mg/kg苯磺隆處理后，油菜種子的發芽勢和發芽率較對照處理分別降低6.81%和5.37%，對種子萌發產生了抑制作用。本研究從谷子種子萌發和幼苗生長的角度對谷子抗性和敏感品種進行抗性鑒定。結果表明，不同濃度的除草劑處理對抗性和敏感性谷子發芽率、存活率和株高的抑制程度明顯不同。抗性材料在安全劑量(250～450 mL/hm2)范圍內，各種鑒定指標基本正常；隨除草劑濃度的增加，抗性材料受藥害程度明顯加重，當除草劑濃度超過450 mL/hm2時，對抗性材料產生致死性的傷害。敏感性材料對除草劑的反應更為敏感，低劑量(＞150 mL/hm2)的除草劑就可對其造成致死性的損傷，本研究與韓玉軍等[17]研究發現的不同濃度乙草胺對玉米種子萌發產生抑制作用的結論相似。

對于農作物而言，噴施除草劑也是一種逆境脅迫，這種非生物脅迫可以達到防控雜草的目的，同時也會導致作物體內抗氧化系統發生相應的應激響應。張麗光等[18]研究發現，在噴施除草劑芐嘧磺隆的初期，隨著芐嘧磺隆濃度的逐漸增加，谷子幼苗葉片中MDA含量呈逐漸增加趨勢，且噴施除草劑初期，谷子葉片中MDA含量的變化趨勢較后期更明顯。徐田軍等[19]對玉米噴施2種除草劑的研究結果也發現，隨著2,4-D-丁酯和煙嘧磺隆濃度的增加，4個玉米葉片中SOD和CAT活性呈降低趨勢，而MDA含量呈增加趨勢。本研究結果表明，葉片噴施不同濃度除草劑后，抗性材料‘安5158’和敏感性材料‘豫谷9號’谷子葉片中保護性酶（CAT、SOD和POD）活性均不同程度下降，而MDA含量則顯著升高，表明噴施除草劑的濃度過高會導致谷子葉片中活性氧物質的大量積累，進而導致葉片中保護酶活性下降。同時，2種不同抗性材料比較，抗性材料的各個生理指標的變化趨勢平穩，而敏感性谷子葉片中活性氧代謝指標變化趨勢明顯，表明抗性材料對除草劑具有較強抗性。

本試驗所使用的咪唑啉酮類除草劑（甲咪唑煙酸）有效成分濃度為240 g/L（水劑），實際田間抗性效應鑒定劑量為250 mL/hm2，與李小童等[20]研究抗咪唑啉酮油菜對選擇性除草劑的抗性效應的最低有效劑量一致。在對抗性材料‘安5158’及敏感性材料‘豫谷9號’噴施咪唑啉酮除草劑15天后，觀察材料抗性效果反應。結果顯示，選育出的抗性材料‘安5158’無藥害反應，對照親本表現出谷子5天左右幼苗心葉開始發黃，然后逐漸變黃，最后整株死亡。擬南芥的ALS酶中與苯磺隆和咪唑啉酮除草劑結合部位的結構研究顯示，苯磺隆和咪唑啉酮都是通過阻斷ALS底物通道方式抑制ALS活性的[21-22]。

通過抗性和敏感性谷子材料表型進行鑒定，表明其正反交F1代對除草劑敏感性表現一致，認為該敏感性基因屬于細胞核遺傳；對群體進行敏感性鑒定，結果出現抗:敏感分離比例為1:1，符合孟德爾遺傳，說明該敏感性基因受單個隱性基因控制。利用常規的雜交和回交等育種手段，可以很方便地將抗咪唑啉酮除草劑基因轉移到其他油菜品系，培育抗咪唑啉酮除草劑的新品種。而且，用抗咪唑啉酮品種做父本配制雜交種，F1仍表現出咪唑啉酮抗性，雜交種施用除草劑1次即可去除假雜種和雜草，獲得整齊一致的雜種群體，有利于雜種純度鑒定和提高雜種的產量與品質。

采用第二代測序平臺進行RNA-Seq高通量測序，通過收集、比對與分析在除草劑莖葉處理條件對谷子葉片中的轉錄本數據，高通量的分離和篩選差異表達基因，將該除草劑抗性基因定位于谷子第1染色體短臂6.8～30.8 Mb區間內，該區間有9個基因差異表達，初步推定為抗咪唑啉酮的候選基因，為抗咪唑啉酮基因的精細定位提供參考。

4 結論

隨著甲咪唑煙酸濃度的逐漸增加，抗性和敏感型谷子材料的發芽率和存活率均呈顯著下降趨勢，且敏感型谷子種子萌發的致死濃度要低于抗性谷子材料。同時，抗性材料在安全劑量(250～450 mL/hm2)范圍內，各種鑒定指標基本正常；隨除草劑濃度的增加，抗性材料受藥害程度明顯加重，當除草劑濃度超過450 mL/hm2時，對抗性材料產生致死性的傷害。敏感性材料對除草劑的反應更為敏感，低劑量(＞150 mL/hm2)的除草劑就可對其造成致死性的損傷，通過群體敏感性鑒定得知，敏感性基因受隱性基因控制，且將抗性基因初步定位在谷子的第1號染色體短臂6.8～30.8 Mb區間內，該區間有9個基因差異表達，推斷為候選基因。