鏡檢和瘧原蟲抗原快速檢測（RDT）膠體金法及巢式PCR法在瘧疾診斷中的價值

梁文嬌

（遼寧省朝陽市疾病預(yù)防控制中心微生物檢測所，遼寧朝陽 122000）

瘧疾是臨床上常見的一種危害性寄生蟲疾病，主要由感染瘧原蟲引起，另外也是通過蚊媒傳播的一種熱帶病，目前廣泛流行于熱帶與亞熱帶地區(qū)，而本地未出現(xiàn)感染病例[1]。因近年來出國務(wù)工人員不斷增加，瘧疾疑似病例也在隨之上升，故臨床對該病診斷的要求更高[2]。目前對于該病的臨床診斷方法較多，如鏡檢、瘧原蟲抗原快速檢測（RDT）膠體金法及巢式PCR法等，各診斷方式的檢出率也存在一定的差異。基于此，本研究選取2019年2月至2020年2月本中心接收的疑似50例瘧疾患者作為研究對象，探究鏡檢、RDT膠體金法、巢式PCR法在瘧疾診斷中的價值，旨在為指導(dǎo)臨床合理抗瘧疾提供重要支持與參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年2月至2020年2月本中心收治的疑似瘧疾患者50例作為研究對象，其中男27例，女23例；年齡18～70歲，平均年齡（54.48±3.27）歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過。納入標(biāo)準(zhǔn)：伴有瘧疾癥狀患者；自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝、腎功能障礙、惡性腫瘤、造血系統(tǒng)疾病及其他相關(guān)疾病者；并發(fā)嚴(yán)重臟器功能衰退者；精神異常者；拒絕參與研究者。

1.2 試劑與儀器試劑：瘧原蟲抗原快速檢測（RDT）膠體金試劑盒（廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司）、DNA提取試劑盒（磁珠法，江蘇碩世生物科技有限公司）、DL2000Marker（寶生物工程）、瓊脂糖，引物由遼寧省疾控所提供。儀器：伯樂IQ5PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)為BIo-BEST（西蒙國際集團）。

1.3 方法

1.3.1 鏡檢法根據(jù)WS 295-2015《瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)》[3]附錄C《病原學(xué)檢查》與WS/T 569-2017《瘧原蟲檢測血涂片鏡檢法》[4]相關(guān)要求制作薄、厚血膜各1張，并染色鏡檢，對血涂片進(jìn)行密切觀察，蟲體密度=瘧原蟲術(shù)/白細(xì)胞數(shù)×每微升血中白細(xì)胞數(shù)-瘧原蟲密度。

1.3.2 RDT膠體金法抽取患者5μL抗凝血，以垂直方式加入反應(yīng)卡加樣區(qū)，在加裂解液區(qū)滴加裂解液4滴，于15 min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.3.3 巢式PCR法①第1輪：PCR，Mix 12.5μL，模板1μL，上下游引各1μL，ddH2O 9.5μL；反應(yīng)程序：94℃3 min，94℃30 s、58℃30 s、72℃60 s，2～4循環(huán)34次后，72℃時，時間為5 min。②第2輪：PCR與反應(yīng)程序與上述一致。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后擴張產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察最終結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo) 以實驗室檢測結(jié)合臨床特征結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較鏡檢、RDT膠體金法、巢式PCR法在診斷瘧疾中的準(zhǔn)確度[準(zhǔn)確度=（真陽性+真陰性）/總例數(shù)]、靈敏度[（靈敏度=真陽/（真陽性+假陽性）]、特異度[特異度=真陰性/（假陰性+真陰性）]、陽性預(yù)測值[陽性預(yù)測值=真陽性/（真陽性+假陽性）]、陰性預(yù)測值[陰性預(yù)測值=真陰性/（假陰性+真陰性）]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料組間率（%）比較采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 診斷結(jié)果經(jīng)實驗室檢測結(jié)合臨床特征結(jié)果顯示，50例疑似瘧疾患者中，陽性36例，陰性14例。

2.2 3種檢查方式診斷效能比較經(jīng)鏡檢法檢出瘧疾28例，檢出率為46.67%；經(jīng)RDT膠體金法檢出瘧疾35例，檢出率為58.33%；經(jīng)巢式PCR法檢出瘧疾30例，檢出率為50.00%；RDT膠體金法準(zhǔn)確度及靈敏度均高于鏡檢法、巢式PCR法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3種診斷方法特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1～4。

表1 鏡檢結(jié)果與檢查結(jié)果比較Table 1 Comparison of microscopic examination results and inspection results

表2 RDT膠體金法診斷結(jié)果與檢查結(jié)果比較Table 2 Comparison of diagnostic results and inspection results of RDT colloidal gold method

表3 巢式PCR法診斷結(jié)果與檢查結(jié)果比較Table 3 Comparison of diagnostic results and inspection results of nested PCR

表4 3種檢查方式診斷效能比較（%）Table 4 Comparison of diagnostic efficiency of 3 inspection methods(%)

3 討論

我國曾將瘧疾的發(fā)生率控制在較低水平，但近期該病疫情呈不斷回升狀態(tài)，表明防治工作仍較嚴(yán)峻。由于該疾病患者在以往使用抗瘧藥物相對較多，對原蟲的正常形態(tài)造成了嚴(yán)重性破壞，導(dǎo)致外周血瘧原蟲抑制作用較強[5-6]。因此，選取適宜的檢查方法，及時、準(zhǔn)確診斷至關(guān)重要，是控制疫情回升、有效預(yù)防及治療瘧疾的關(guān)鍵。

鏡檢是顯微鏡檢查的簡稱，是指將待檢標(biāo)本取樣、制片、觀察（顯微鏡下）、分析、判斷。RDT膠體金法又稱金標(biāo)法，具有簡便快捷、適用性廣等特點，該診斷方法能準(zhǔn)確的診斷出大部分陽性者，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗[7]。巢式PCR法屬于一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可充分利用2對PCR引物對完整的片段進(jìn)行擴增，第1對PCR引物擴增片段接近于普通的PCR，而第2對引物可將其稱之為巢式引物結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，使第2次PCR擴增片段明顯短于第1次[8]。有研究[9]報道，快速檢測條法對卵形瘧的準(zhǔn)確性并不理想，但應(yīng)用于本研究樣本檢測中，顯示為陽性，該結(jié)論可能與患者體內(nèi)pLDH含量及帶蟲率相關(guān)。膠體金法難以區(qū)分惡性瘧以外的其他瘧疾，故常依賴鏡檢與巢式PCR法加以區(qū)別。本研究結(jié)果表明，RDT膠體金法準(zhǔn)確度及靈敏度均高于鏡檢法、巢式PCR法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；3種診斷方法特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分析原因為，給予患者治療瘧原蟲前，在紅細(xì)胞中呈現(xiàn)的形態(tài)不僅完整，且密度高，通過鏡檢較易檢出，而瘧原蟲在藥物治療中出現(xiàn)破壞（本身形態(tài)）、分解及裂解等不良情況下，增加了染色鏡檢的檢出難度系數(shù)，故檢出率低。對于低流行區(qū)，在分子生物學(xué)診斷技術(shù)中，膠體金法的特異性強、靈敏度高等優(yōu)勢可能與本研究樣本量較少有關(guān)，其次膠體金試劑仍在不斷的改進(jìn)中，與其自身敏感性提高有關(guān)。隨著境外輸入病例的不斷上升，復(fù)雜的臨床表現(xiàn)及用藥等均影響陰性檢出率，故在瘧疾流行區(qū)的基層工作中，將3種診斷方法相互結(jié)合與補充，有助于提高診斷率[10]。

綜上所述，在瘧疾臨床診斷中，膠體金法具有較高的靈敏度及檢出率，可與鏡檢、巢式PCR法聯(lián)合診斷，以進(jìn)一步提高檢出率，為臨床提供重要依據(jù)。