響應面優化人參果鐵皮石斛花復合果酒生產工藝

劉琨毅，羅慧，李崇萍，馬燕，2，程建勝，趙菊潤，張新鳳，趙明，2*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，龍潤普洱茶學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.宜賓職業技術學院五糧液技術與食品工程學院，四川 宜賓 644003；4.云南品斛堂生物科技有限公司，云南 德宏 678400；5.龍陵縣石斛研究所，云南 寶山 678300；6.浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

人參果是一種漿果類作物，其果肉清爽多汁，味道清甜，富含維生素和微量元素，特別是鈣和硒含量高于大多數水果[1-2]，具有消炎、抗衰老、補鈣、降血壓、降血糖、美容等功效[3]。因此，將人參果加工成各類產品會有較大的市場潛力。鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是我國傳統名貴藥材，在其種植過程中盛開的石斛花，不僅具有觀賞價值，而且具有重要的開發價值[4]。鐵皮石斛花作為一種新食品原料[5]，其含有豐富的多糖、氨基酸、黃酮等營養成分，具有抗氧化、抗腫瘤、調節免疫等藥理作用[6-7]。目前鐵皮石斛花的相關產品還停留在初加工水平，造成了一定的資源浪費[8]，因而有必要開發其高附加值的產品。

復合型發酵酒是利用兩種或多種富含可發酵性糖釀造而成的低酒精度飲品[9]，經過釀造工藝優化后能夠綜合幾種原料的香味、風味物質及營養成分，使產品的口感、香氣及滋味更加豐富[10-11]。基于此，在單因素試驗的基礎上運用響應面法，以人參果和鐵皮石斛花為主要原料，探究人參果鐵皮石斛花復合果酒感官評分和酒精度含量最高時的最優生產工藝，并檢測其黃酮類物質的含量，為人參果和鐵皮石斛花資源的開發利用提供一定的參考價值，為新型復合果酒的研發、釀造提供數據支撐和指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛花：于2018年5月采自云南品斛堂生物科技有限公司云南龍陵石斛種植基地，采摘后烘干，粉碎后過40目篩，待用；新鮮人參果、白砂糖：市售；釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；鞣花酸、楊梅素、蘆丁、槲皮素、山奈酚、花旗松素：成都曼思特生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀、維生素 C（vitamin C，VC）（均為食品級）：天津市大茂化學試劑廠；檸檬酸（食品級）：湖北鑫潤德化工有限公司。

1.2 儀器與設備

CP214型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；HH-S28S型數顯恒溫水浴鍋；金壇市大地自動化儀器廠；JHBE-50T型閃式提取器：河南智晶生物科技股份有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LRHS-250-II型生化培養箱：上海躍進器械有限公司；1200型高速液相色譜系統：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 人參果鐵皮石斛花復合果酒生產工藝流程

人參果→洗滌→榨汁→裝瓶→添加鐵皮石斛花粉→成分調整→巴氏滅菌→接種→主發酵→固液分離→低溫貯存→過濾→成品

操作要點：選取新鮮的人參果去皮后放入閃式提取器中榨汁[料水比 1∶1（g/mL）]，并加入 0.08%VC用于護色，取100 mL加入250 mL的三角瓶內，按照一定比例添加鐵皮石斛花粉，加糖調整到試驗所需糖度并加入0.01%偏重亞硫酸鉀，利用檸檬酸將果汁的pH值調整為4.0，巴氏滅菌（65℃、30 min）后待冷卻按體積分數接入一定量經活化后的酵母菌懸液（在釀酒酵母粉中加入10倍質量30℃的純凈水，活化20 min），在一定溫度條件下發酵，主發酵7 d結束；固液分離后15℃貯存3 d，4層紗布過濾后得到成品。

1.3.2 人參果鐵皮石斛花復合果酒生產工藝單因素優化試驗

參考劉琨毅等[12]的方法，在4%鐵皮石斛花添加量、20.0%初始糖度、0.03%釀酒酵母接種量及22℃發酵溫度的基礎條件下，每次只改變4個因素中的1個因素，保持其他因素不變，分別設置鐵皮石斛花添加量（0%、2%、4%、6%、8%）、初始糖度（15.0%、17.5%、20.0%、22.5%、25.0%）、釀酒酵母接種量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）及發酵溫度（18、20、22、24、26℃），以感官評分及酒精度為指標，每組試驗重復3次進行單因素試驗。

1.3.3 人參果鐵皮石斛花復合果酒生產工藝響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，以鐵皮石斛花添加量（A）、初始糖度（B）、釀酒酵母接種量（C）、發酵溫度（D）為4個因素，以感官評分（Y1）和酒精度（Y2）為考察指標設計進行響應面試驗。

1.3.4 人參果鐵皮石斛花復合果酒感官評價方法

感官評分由11名（6男5女）品酒師組成的感官評定小組參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]對人參果鐵皮石斛花復合果酒從外觀、香氣、滋味、風格4個方面進行感官評分，滿分100分，每個樣品的感官評分取平均分，評分標準見表1。

表1 人參果鐵皮石斛花復合果酒的感官評分標準Table 1 Sensory score standards of pepino fruit and D.officinale′s flower compound fruit wine

1.3.5 人參果鐵皮石斛花復合果酒黃酮類物質測定方法

按照前期建立的方法，應用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 檢測人參果鐵皮石斛花復合果酒中黃酮類成分，并根據峰面積使用外標法進行定量分析[14]。

1.4 數據分析

以上每個試驗重復3次，結果以平均值±標準差表示。采用OriginPro 12.1軟件進行數據制圖，應用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，利用Design Expert 10.1軟件進行響應面設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 人參果鐵皮石斛花復合果酒單因素試驗

不同鐵皮石斛花添加量對人參果石斛花復合果酒品質的影響如圖1所示。

圖1 不同鐵皮石斛花添加量對人參果石斛花復合果酒品質的影響Fig.1 Effects of different addition of D.Officinale′s flower on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

由圖1可知，隨著鐵皮石斛花添加量的增加，人參果鐵皮石斛花復合果酒的感官評分呈現先升后降的趨勢。鐵皮石斛花添加量為6%時，復合果酒感官評分達到最高，為84.7±0.8；當鐵皮石斛花添加量繼續增加后，復合果酒的感官評分顯著下降（P＜0.05）。當鐵皮石斛花添加量較低（＜6%）時，復合果酒香氣較為寡淡，故造成復合果酒的感官評分不高；當鐵皮石斛花添加量較高時（＞6%），人參果香氣不突出且復合果酒的香氣不愉悅。加之復合果酒的酒精度不隨鐵皮石斛花添加量的變化而顯著變化（P＞0.05），由此，選擇鐵皮石斛花添加量為6%用于后續試驗。

不同初始糖度對人參果石斛花復合果酒品質的影響如圖2所示。

圖2 不同初始糖度對人參果石斛花復合果酒品質的影響Fig.2 Effects of different initial sugar content on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

由圖2可知，當初始糖度從15.0%增加至22.5%時，人參果鐵皮石斛花復合果酒的感官評分呈上升趨勢，其感官評分最高分為86.2±1.1；當初始糖度繼續增加后，復合果酒的感官評分反而下降。初始糖度直接影響復合果酒的發酵過程，糖分是酵母發酵主要動力來源，在發酵過程中，糖分轉化成乙醇、酸類、酯類等物質[15]。初始糖度過低，酵母發酵動力不足；初始糖度過高，導致復合果酒殘糖過多影響感官品質[16]。雖然酒精度隨著初始糖度的增加而增加，但是初始糖度從22.5%增加到25.0%時酒精度增加了3.4%，但感官評分卻下降較多。綜合考慮復合果酒感官評分和酒精度，選擇初始糖度為22.5%進行后續試驗。

不同釀酒酵母接種量對人參果石斛花復合果酒品質的影響如圖3所示。

由圖3可知，隨著釀酒酵母接種量的逐漸增加，復合果酒的感官評分與酒精度均呈先上升后下降的趨勢。在釀酒酵母接種量為0.04%時，感官評分與酒精度均達到最高值，分別為 88.7±0.7、（11.7±0.1）%vol。釀酒酵母是主要的產酒精的微生物，在發酵過程中生成酒精及其他的香氣成分[17]。酵母接種量較低時，不能充分發酵糖分，導致糖分過剩，酒精度過低；而過高的酵母接種量，并不能提高復合果酒的酒精度，反而使發酵不完全[18]。綜合考慮，選擇釀酒酵母接種量為0.04%進行后續試驗。

圖3 不同釀酒酵母接種量對人參果石斛花復合果酒品質的影響Fig.3 Effects of different inoculation of S.cerevisiae on the quality of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

不同發酵溫度對人參果石斛花復合果酒品質的影響如圖4所示。

由圖4可知，發酵溫度直接影響復合果酒的品質，當發酵溫度從18℃上升至26℃時，復合果酒感官評分呈現出先升高后降低的趨勢。當發酵溫度為22℃時，復合果酒感官評分達到最高分，為88.7±0.7。復合果酒的酒精度隨著發酵溫度的升高而增加，當發酵溫度從24℃升高至26℃時，酒精度增加不再顯著（P＞0.05）。當發酵溫度為18℃時，酵母菌生長相比22℃時受到一定的抑制，酒體發酵不充分，復合果酒酒精度偏低進而影響感官品質；當發酵溫度從22℃升高至26℃時，酵母菌的生長速度逐漸加快、代謝活躍，導致酒體整體風味不佳進而促使感官評分顯著降低[18]。綜合考慮，選擇發酵溫度為22℃進行后續試驗。

2.2 人參果鐵皮石斛花復合果酒響應面法試驗

人參果鐵皮石斛花復合果酒生產工藝優化響應面試驗設計及結果見表2。

表2 人參果鐵皮石斛花復合果酒生產工藝優化響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

對試驗數據進行方差分析[19]，結果如表3所示。

表3 響應面結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results

分別以感官評分（Y1）和酒精度（Y2）為響應值，經回歸擬合后，得到相應的回歸方程：Y1=87.74＋1.43A-0.27B-0.47C-1.55D-1.78AB-0.65AC-0.85AD+0.30BC＋0.48BD＋2.38CD-3.15A2-3.92B2-4.23C2-1.74D2；Y2=12.34＋0.20A-0.03B-0.06C-0.23D-0.23AB-0.08AC-0.10AD＋0.05BC＋0.08BD＋0.35CD-0.39A2-0.54B2-0.55C2-0.20D2。

根據方差分析，模型極顯著（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05），表明未知因素對試驗結果的干擾較小（表3），可以通過模型確定以感官評分與酒精度為響應值時人參果鐵皮石斛花復合果酒釀造的最佳工藝條件[20-21]。感官評分的相關系數R2=0.8957、R2adj=0.7914，酒精度的相關系數R2=0.894 5、R2adj=0.788 9，說明感官評分和酒精度的試驗值與預測值之間有較好的擬合度；感官評分與酒精度的變異系數（C.V.）分別為1.93%、1.85%，均小于5.00%，表明模型重現性較好。4個因素對復合果酒感官評分的影響次序為D＞A＞C＞B，即發酵溫度對復合果酒感官評分的影響最為顯著，其次是鐵皮石斛花添加量，再次是釀酒酵母接種量。一次項 A、D，交互項 CD，二次項 A2、B2、C2對復合果酒感官評分的影響極顯著（P＜0.01）；交互項AB，二次項D2對復合果酒感官評分的影響達到了顯著水平（P＜0.05）。各因素交互作用對人參果鐵皮石斛花復合果酒感官評分影響的響應曲面結果見圖5。

由圖5可知，4個因素的兩兩相互作用中，因素C與因素D所形成的響應面曲面坡度最為陡峭與方差分析中交互項CD對復合果酒感官評分的影響極顯著（P＜0.05）的結論相吻合。

圖5 各因素交互作用對人參果鐵皮石斛花復合果酒感官評分影響的響應曲面Fig.5 Response surface plot of interactive of various factors on sensory evaluation of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

由表3知，發酵溫度對復合果酒酒精度的影響最為顯著，其次是鐵皮石斛花添加量，再次是釀酒酵母接種量，最后是初始糖度。一次項A、D，交互項CD，二次項A2、B2、C2對復合果酒酒精度的影響極顯著（P＜0.01）；二次項D2對復合果酒酒精度的影響達到了顯著水平（P＜0.05）。各因素交互作用對人參果鐵皮石斛花復合果酒酒精度影響的響應曲面結果見圖6。

由圖6可知，4個因素的兩兩相互作用中，因素C與因素D所形成的響應面曲面坡度最為陡峭，表明釀酒酵母接種量與發酵溫度的交互作用對復合果酒酒精度的影響最為顯著。

圖6 各因素交互作用對人參果鐵皮石斛花復合果酒酒精度影響的響應曲面Fig.6 Response surface plot of interactive of various factors on alcohol content of pepino fruit and D.officinale flower compound fruit wine

通過響應面軟件分析，復合果酒在鐵皮石斛花添加量6.84%、初始糖度22.03%、釀酒酵母接種量0.04%、發酵溫度為20.42℃的條件下，感官評分可獲得最高的理論值89.749 6；在鐵皮石斛花添加量6.97%、初始糖度21.95%、釀酒酵母接種量0.04%、發酵溫度為20.00℃的條件下，酒精度可獲得最高的理論值12.530 7%vol。后續在鐵皮石斛花添加量7%、初始糖度22%、釀酒酵母接種量0.04%、發酵溫度為20℃的條件下進行3組平行試驗，其感官評分與酒精度分別為 90.1±0.8 與（12.5±0.1）%vol，測定結果穩定與理論值相差不大，證明該結果合理可靠。

2.3 人參果鐵皮石斛花復合果酒黃酮類物質分析

測定人參果鐵皮石斛花復合果酒在經響應面優化后的工藝條件下黃酮類物質的含量，結果如表4所示。

表4 人參果鐵皮石斛花復合果酒黃酮類物質含量Table 4 The Content of flavonoids in pepino fruit and D.Officinale′s flower compound fruit wine μg/mL

在復合果酒中檢測出4種黃酮類物質，分別為花旗松素、蘆丁、鞣花酸和楊梅素，其總含量為（168.1±13.4）μg/mL。研究表明，上述4種物質均具有重要的生物活性，如花旗松素具有抗氧化、抗炎、抑制腫瘤等生理功能[22]；蘆丁對痛風、心血管疾病和糖尿病的治療有一定作用[23]；鞣花酸能夠預防人類骨肉瘤[24]；楊梅素可以改善由免疫應答引起的炎癥反應[25]。

3 結論

經過響應面試驗得到人參果鐵皮石斛花復合果酒的最優釀造條件：在鮮榨的人參果汁中添加7%鐵皮石斛花，并加入0.08%VC，調整初始糖度為22%與pH值為4.0，隨后加入0.01%偏重亞硫酸鉀，巴氏滅菌后接入0.04%釀酒酵母，于20℃條件下發酵7 d，固液分離，液體15℃貯存3d。在此條件下可獲得淺黃透明、酒香和諧、滋味爽口，感官評分為90.1±0.8，酒精度（12.5±0.1）%vol和黃酮類物質含量（168.1±13.4）μg/mL的人參果鐵皮石斛花復合果酒，其中發酵溫度對復合果酒感官評分與酒精度的影響最為顯著，其次是鐵皮石斛花添加量，再次是釀酒酵母接種量，最后是初始糖度。試驗結果為拓寬人參果與鐵皮石斛花的應用范圍提供了理論依據。