中國漢族心肌病患者FLNC 基因變異的家系研究

李雪潔 周年偉 孫敏敏 李 偉 汪詠蒔 謝惠琳 舒先紅

（1復旦大學附屬中山醫院心超室，2心內科 上海 200032；3上海市影像醫學研究所 上海 200032；4上海市心血管病研究所 上海 200032）

FLNC編碼的細絲蛋白C（filamin C，FLNC）是一種廣泛存在于心肌及骨骼肌中的蛋白質，以同源二聚體的形式表達，主要通過與肌動蛋白交聯維持肌節的機械穩定性。最初，FLNC基因突變在肌原纖維肌病中被發現，近年來在肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）、擴張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）、限制型心肌病（restrictive cardiomyopathy，RCM）和致心律失常性心肌病（arrhythmogenic ventricular cardiomyopathy，ACM）中也被陸續報道。隨著基因篩查在臨床中的應用，FLNC已經成為遺傳性心臟病的常見致病基因之一，在HCM 和RCM 患者中發現了許多FLNC的錯義突變，DCM 及ACM 患者中發現的則多為截斷突變，這表明不同類型的FLNC突變可能存在不同的致病機制。然而中國漢族人群心肌病患者攜帶FLNC突變的變異譜仍不明確，其基因型-表型的關聯性也值得進一步探究和討論。

資料和方法

入組人群2018 年至2020 年就診于復旦大學附屬中山醫院的150 名無血緣關系的漢族HCM 患者和50 名DCM 患者被納入研究。成年人HCM 的臨床診斷標準與以往文獻一致：一個或多個左室心肌節段的最大室壁厚度≥15 mm，或有明確家族史者最大室壁厚度≥13 mm（排除后負荷增加），通常不伴有左室擴大；家族性HCM 定義為在同一家系中有兩名以上的HCM 患者。DCM 的臨床診斷標準為具有心室擴大和心肌收縮功能降低的客觀證據：左室舒張末內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDd）>5.0 cm（女性）和 LVEDd>5.5 cm（男性）（或>年齡和體表面積預測值的117%，即預測值的2 倍SD+5%）；左室射血分數（left ventricular ejection fractions，LVEF）<45% 和左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）<25%，除外冠心病、高血壓病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、系統性疾病等；家族性DCM 定義為同一家系中有2 名或2 名以上的DCM 患者。收集患者的臨床信息，包括發病年齡、確診年齡、性別、癥狀、是否植入起搏器，并常規進行心電圖（electrocardiogram，ECG）和 經 胸 超 聲 心 動 圖（transthoracic echocardiography，TTE）檢查。該實驗方案經過復旦大學附屬中山醫院人類倫理委員會批準［B2016-016（2）R］，所有納入本研究的患者均已簽署知情同意書。

全外顯子組測序及變異解釋提取入組患者的外周血基因組DNA，在HiSeq XTEN 測序平臺（美國Illumina 公司）上進行全外顯子組測序。具體測序方法詳見本課題之前的研究［1-2］。測序后使用GATK（Genome Analysis Tool kit）進行變異檢測及初步分析，其中使用到多種人類基因突變和疾病相關數據庫，包括OMIM、1000G 和dbsnp 等。根據美國醫學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的序列變異解釋標準和指南［3］，變異的致病性分為5 級：致病的（pathogenic，P），可能致病的（likely pathogenic，LP），意義不明確的（variant of uncertain significance，VUS），可能良性的（likely benign，LB）和良性的（benign，B）。一般情況下FLNC截斷變異被歸類為致病的（P）；除非有來自共分離或功能性實驗的額外證據，錯義變體被歸類為意義不明確的（VUS）。使 用 Polyphen-2、SIFT、PROVEAN 和 Mutation Taster 預測錯義變異，使用PROVEAN 和Mutation Taster 預測無義變異、插入和缺失（Insertion and Deletion，InDel），篩選出被解讀為致病的（P）和可能致病的（LP）變異，進行Sanger測序驗證及臨床研究。

致病性預測變異篩選及驗證流程見圖1。滿足下列條件的變異認為是可能致病的（P）：（1）在dbSNP 等人群數據庫中未報道；（2）變異位于進化上高度保守位點；（3）在人類基因突變數據庫中已有記錄的心肌病及離子通道病相關基因上的特殊變異類型，如移碼變異、終止獲得/缺失變異、剪接位點變異；（4）在家系中該變異與疾病表型共分離；如果家系資料不適用于共分離，則致病性判斷通過預測軟件判斷均為有害或可能有害的。

圖1 患者全外顯子測序及基因變異篩選流程圖Fig 1 Flow chart of whole exome sequencing and variants screening

結 果

本研究共發現6 個FLNC變異（編號為1~6），均未見報道，包括HCM 患者的3 個錯義變異，DCM 患者的1 個無義變異（截斷變異）和1 個InDel變異，RCM 患者的 1 個錯義變異，其中 1 例 DCM 為家族性，其余均為散發性病例。6 名患者均為男性，先證者及攜帶相同變異的家屬詳細臨床資料見表1，各變異的位點、類型、致病性預測等數據見表2 及圖 2。

表1 攜帶FLNC 變異的心肌病患者的臨床信息Tab 1 Clinical information of cardiomyopathy patients with FLNC variation

表2 患者攜帶的FLNC 變異信息Tab 2 Information of the FLNC variants detected in this study

1 號 RCM 患者，男性，44 歲，20 年前情緒激動后暈厥，在當地醫院診斷為心肌肥厚，但未進一步隨訪和診療，直至4 年前頻繁出現心悸、活動后氣促，呈進行性加重，平地行走50 m 以上不能耐受，遂至當地醫院檢查，ECG 示心房撲動和心房顫動伴快速心室率。2017 年12 月患者就診于我院，TTE 示：左室壁厚度13~22 mm，左室及右室收縮活動減弱，LVEF49%，雙房明顯增大伴輕度二尖瓣及三尖瓣反流；診斷為非梗阻性HCM，予抗凝、控制心室率等治療，癥狀有所緩解。1 年前因頻發心悸再次就診，2019 年 7 月 ECG 示心房撲 動，2：1 房室傳導；TTE 示：左右室壁增厚伴左右室壁整體收縮活動減弱（LVEF 50%），雙房增大伴輕度二尖瓣及三尖瓣反流；心臟MRI 示：符合限制性心肌病改變，心肌淀粉樣變待排；進一步行免疫固定電泳，結果呈陰性，最終確診為RCM。

2 號DCM 先證者攜帶FLNC的截斷變異及MYBPC3的錯義變異（測序峰圖及臨床資料見圖2），因患者母親沒有出現心肌病相關表型，未進行基因檢測，無法證實是否為FLNC的新發變異；MYBPC3錯義變異為罕見變異（GnomAD 中頻率為0.000016），預測為可能致病或有害的。15 年前出現勞累后胸悶，診斷為DCM，予卡維地洛、培哚普利等藥物治療，病情平穩，2011 年5 月隨訪TTE示：左室顯著增大，左室心尖部見豐富海綿狀心肌成蜂窩狀伴左室壁整體收縮活動減弱，LVEF33%，繼續藥物治療，2012 年至2017 年多次隨訪TTE，LVEF 波動于30%~47%，ECG 提示Ⅱ度二型房室傳導阻滯，2017 年11 月因上呼吸道感染后出現急性左心衰伴呼吸性代謝性堿中毒，經過抗感染、強心、利尿等治療，病情仍進一步惡化，2018 年1 月因心衰、肝性腦病死亡。其父親攜帶了相同的MYBPC3變異，11 年前因反復胸悶氣促診斷為DCM，Ⅱ度二型房室傳導阻滯（最長R-R 間期3.2 s）并行起搏器植入術。2012 年TTE 示：左房室擴大伴左室整體收縮活動減弱，LVEF31%，右房增大，中度三尖瓣反流；后多次隨訪TTE 心功能無明顯惡化，病情平穩。

圖2 2 號DCM 患者及其父親的家系圖、測序峰圖及臨床資料Fig 2 The family tree，chromatogram and clinical data of DCM 2 and his father

5 號DCM 患者20年前體檢時發現二葉式主動脈瓣，18 年前出現活動后胸悶，于當地診斷為陣發性房顫，左房增大，未系統治療。10 年前胸悶癥狀明顯加重，就診于我院，診斷為DCM。2010 年7 月，TTE示：先天性二葉縱裂式主動脈瓣畸形，輕度主動脈瓣反流，左室增大伴左室壁收縮活動減弱，LVEF35%，雙房增大伴輕度二尖瓣及中度三尖瓣反流；ECG 示：持續性房顫；于我院行 CRT-D 術。2018 年 3 月，隨訪心超示：CRT 術后雙房及左室擴大，左右室整體收縮活動減弱，LVEF28%，病情平穩。

剩余3 例HCM 患者發病年齡分別為32、62 和25歲，室間隔和左室最大厚度分別為17、14、14 mm 和22、17、19 mm，3 名患者均表現出典型的勞力性呼吸困難和胸痛，就醫后診斷為HCM，3 人均無左室流出道梗阻，LVEF 正常。予美托洛爾治療，病情均穩定。

討 論

Z 盤對于心臟的重要性眾所周知，其維持著心臟正常的機械活動，也參與多種生化途徑相關信號的接收和傳輸，FLNC 通過與多個Z 盤蛋白相互作用，可以承受肌節上的強收縮力［4］。FLNC 蛋白由3個結構域組成（圖3），位于氨基端的肌動蛋白結合結構域由2 個鈣調蛋白同源結構域組成，連接24 個重復串聯的免疫球蛋白樣結構域，免疫球蛋白樣結構域又由ROD1 和ROD2 兩個鉸鏈區及羧基端的二聚化結構域組成，FLNC 蛋白形成二聚體后才能與肌動蛋白結合。FLNC 蛋白不同結構域及不同類型的致病變異會導致不同的臨床表型。ROD2 域是絲蛋白C 與Z 盤蛋白之間相互作用的重要區域，此結構域的錯義突變會通過顯性負性作用產生異常的蛋白聚體（包含無法正常二聚的FLNC 和一些Z 盤相關蛋白），蛋白聚體在細胞質中積累導致肌節的排列及功能紊亂，產生 HCM 和 RCM［5-6］；位于肌動蛋白結合域的錯義突變會產生毒性的功能獲得，增強肌動蛋白結合活性導致肌病；而整個基因上的截斷突變與DCM 和ACM 有密切關聯，其通過無義介導的mRNA 降解機制產生基因單倍體不足，導致Z盤增厚紊亂，細胞間黏附減弱，影響橫紋肌的機械傳導［7-11］。攜帶FLNC錯義突變的骨骼肌病患者有一小部分存在心臟表型［12］，而FLNC相關心肌病患者罕有骨骼肌受累［7］。本研究中所有患者均無骨骼肌受累的表型，為什么FLNC錯義突變相關HCM、RCM 患者骨骼肌中無蛋白聚體，現在還難以解釋。修飾基因對FLNC表現度的影響、表觀遺傳學因素等可能共同作用于FLNC突變表型的復雜性，如果能夠發現相同突變激活的不同通路，對于尋找潛在的治療靶點可能存在重要的意義。

圖3 FLNC 的結構域及本研究發現的變異分布Fig 3 Structure domains and variations distribution of FLNC in our research

以往研究證明FLNC變異在HCM 患者中較常見，其與肌節蛋白突變導致的HCM 在臨床表型及預后方面沒有明顯差異［13］，本研究中 3 個 HCM 患者攜帶的FLNC錯義變異預測為可能致病，但是臨床意義未知，因此FLNC變異對于HCM 患者的表型影響可能需要謹慎解釋。在以往報道的病例中，FLNC相關DCM 的惡性程度更高，表現出與心室擴張程度不符的室性心律失常、心源性猝死高風險等特點［14］。本研究中 2 例 DCM 患者表現為發病年齡早，心功能惡化速度快，未觀察到惡性室性心律失常；對于多種心肌病、多個基因突變或復合突變的攜帶者終末期進展、心律失常和預后不良的風險明顯增加［15-17］，2 號 DCM 患者同時攜帶雙基因雜合變異，且均預測為可能致病的變異，與僅攜帶單基因變異的患者父親相比，臨床表現為發病年齡早，心功能惡化速度快伴隨傳導系統受累，這也符合之前的研究結果。有不同的研究者在HCM 及RCM患者中發現了相同的錯義突變（p.Ser1624Leu），提出攜帶該突變的家系可能存在HCM 和RCM 混合的表型［12，18］；本研究中，RCM 患者在發病初期僅表現為心肌肥厚，早期診斷為HCM，隨著病程進展出現雙房擴大，舒張功能明顯受限，最終確診為RCM，3 號HCM 患者與RCM 患者攜帶的變異堿基位點相鄰，導致相同的氨基酸替換，隨著年齡增加是否會進展成為RCM 尚不明確，我們將對此患者進行定期隨訪。

本研究對200 名漢族不同亞型心肌病患者進行全外顯子組測序，討論了在200 例漢族心肌病患者中FLNC基因的變異特點，擴大了心肌病中FLNC基因的變異譜，并進一步探討了在不同心肌病中FLNC變異的基因型和表型相關性。我們觀察到變異類型對于臨床特點有決定性作用，錯義突變干擾了蛋白質的二聚和折疊會導致HCM、RCM，截斷突變會通過單倍體不足導致細胞間黏附減弱，產生發病年齡早、進展快速的DCM。本研究不足之處在于作為單中心研究納入的人數較少，且未納入ACM 患者，這種心肌病中FLNC的突變譜及機制需要進一步的挖掘，另外本研究發現的變異需要在更大樣本的心肌病患者中進行對比和驗證，同時獲得更多功能驗證實驗的證據，以進一步確定其致病性。

作者貢獻聲明李雪潔 數據采集，論文撰寫。周年偉，孫敏敏，李偉，汪詠蒔，謝惠琳 數據采集。舒先紅 論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。