高效液相色譜法測定山杏內種皮磷脂類化合物

鮑宇宏

【摘 要】以山杏內種皮為原料，高效液相色譜-紫外檢測器法測定磷脂含量，采用ZORBAX Rx-SIL型硅膠柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動相為乙腈-甲醇（15：85，體積比），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，測得山杏內種皮中磷脂酰乙醇胺（PE）含量為0.393 4 mg/g。

【關鍵詞】磷脂；高效液相色譜分析；山杏內種皮

山杏是我國北方干旱山地丘陵區特有的經濟林樹種，目前對山杏的研究主要集中在對山杏仁的研究，山杏內種皮通常作為杏仁加工廢料被丟棄，未見有對磷脂類物質提取及分析的報道。本文以山杏內種皮為原料，研究山杏內種皮磷脂類化合物，利用高效液相色譜法測定含量，以便為生產中提取、測定山杏內種皮磷脂類化合物提供技術依據，為山杏資源的充分開發利用提供參考。

一、材料與方法

1.1儀器

AR1140型電子天平：梅特勒-托利多公司；KQ-500DE型超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司； TGL16M型高速冷凍離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；DGG-9023A電熱恒溫真空干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；JP-500C粉碎機：永康市久品工貿有限公司； Milli-Q Academic超純水儀：美國密理博公司；ZORBAX Rx-SIL：美國安捷倫公司；LC-16高效液相色譜儀：日本島津公司；SPD-16檢測器：日本島津公司。

1.2 材料與試劑

山杏仁，浸泡去皮，種皮洗凈，風干，粉碎，過篩（80目），干燥器中保存。

磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）標準品：Sigma公司；甲醇、乙腈、正己烷、無水乙醇：天津市大茂化學試劑廠；氯仿、氯化鈉：天津市津科精細化工研究所。液相色譜所用試劑均為色譜純，且經過0.45 μm濾膜過濾并超聲脫氣。其他試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1 制備磷脂類化合物標準溶液

精密稱取一定量的磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰膽堿（PC）標準品分別置于2 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得標準品儲備液，各標準品質量濃度分別為PG：1.60 mg/mL，PC：1.60 mg/mL，PE：1.40 mg/mL。分別移取一定量的各標準品儲備液于2 mL容量瓶中，用甲醇定容得混合標準溶液。

1.3.2 制備樣品

稱取樣品1.000 0 g，加入正己烷-甲醇（1：1，體積比）試劑15 mL，超聲功率450 W，超聲提取50 min，放置至室溫，加正己烷-乙醇提取試劑補至原重，6 000 r/min離心10 min，取上清液用適量的0.75 %氯化鈉溶液萃取2次，收集有機相。將有機相旋轉濃縮至近干，用甲醇定容至10 mL。取樣品溶液1 mL，甲醇稀釋至10 mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Rx-SIL柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈：甲醇=15：85（體積比）；等度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為206 nm；進樣量為20 μL。

二、結果與分析

2.1 流動相的選擇

試驗考察了流動相為乙腈、甲醇、乙腈-甲醇等不同組成及比例時3種磷脂類化合物的分離情況。試驗結果可知，由流動相為100 %甲醇或100 %乙腈時，PG和PE出峰時間相近，分離度差，最終確定乙腈-甲醇（15：85，體積比）為流動相。

2.2 流速的選擇

試驗中選取流速分別為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min，考察流速的不同對磷脂各組分的分離度、出峰時間及信號強度的影響。流速越小，出峰越慢，且峰形不好，分叉或跟有若干小峰，流速越大，出峰時間越快，峰形越好，但PE與PG出峰時間越接近。綜合考慮，確定流速為1.0 mL/min。

2.3 柱溫的選擇

試驗考察了不同柱溫對分離效果的影響。色譜柱溫度升高，柱壓下降，色譜峰與雜質分離充分，峰形良好，利于檢測結果的分析，但長時間保持較高溫度，磷脂易發生氧化或分解反應，導致檢測結果不準確。試驗結果表明，在 35 ℃的條件下檢測效果最好。

2.4 色譜條件的優化

根據試驗結果，高效液相色譜法分析磷脂類化合物的條件：流動相為乙腈-甲醇（15：85，體積比），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃。在此條件下，3種磷脂類化合物標準品色譜分離情況最佳。

2.5 標準曲線的繪制

分別取1.3.1制備的磷脂標準品儲備液，用甲醇稀釋成一系列標準工作液，按1.3.3色譜條件進行測定。以標準品濃度為橫坐標，以峰面積×10-6值為縱坐標進行線性回歸。以信噪比S/N=3測定的結果計算檢出限。

2.6 精密度試驗

將混合標準品溶液按1.3.3色譜條件進行測定，重復測定6次，3種磷脂化合物峰面積的RSD值分別為：PG1.53 %， PC1.01 %， PE1.17 %，儀器精密度良好。

2.7 樣品測定

精密稱取山杏內種皮樣品，按1.3.2試驗方法處理，在1.3.3色譜條件下測定，平行測定6次。根據回歸方程計算山杏內種皮PE含量為0.3934mg/g。

2.8 穩定性試驗

將樣品溶液按1.3.3色譜條件每隔2小時測定一次，重復6次，PE峰面積的RSD值為1.23 %，樣品溶液在10 h內穩定。

2.9 回收率試驗

稱取山杏內種皮樣品1.0000g置于具塞錐形瓶中，分別加入一定體積的磷脂標準品儲備液，按1.3.2試驗方法處理樣品，按1.3.3色譜條件測定。

三、結論

本文探討了高效液相色譜檢測山杏內種皮中磷脂類化合物的方法。采用ZORBAX Rx-SIL型硅膠柱（4.6 mm×250 mm， 5μ m），檢測磷脂類化合物條件為：流動相為乙腈-甲醇（15：85，體積比），等度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL，山杏內種皮磷脂酰乙醇胺（PE）含量為0.393 4 mg/g。本研究為山杏資源的進一步開發利用提供一定的參考。

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