高效液相色譜法測定啶氧菌酯懸浮劑及水分散粒劑中有效成分含量

馬騰飛，賈孫悅，劉 琳，周 芹,3,4，高金勝

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150080；2黑龍江大學(xué)化學(xué)化工與材料學(xué)院，哈爾濱150080；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱150080；4農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，哈爾濱150080）

0 引言

啶氧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥，是一類低毒、高效、廣譜的殺菌劑，20世紀(jì)80年代發(fā)展起來并且在90年代首次引入市場[1]，由于其良好的環(huán)境相容性，在短短十余年時間已成為農(nóng)用殺菌劑中的主流產(chǎn)品之一，銷售市場已超過三唑類，在各類殺菌劑中位列首席[2]。這類殺菌劑的活性位點是甲氧基丙烯酸（酯/酰胺），通過抑制真菌的線粒體呼吸鏈中細(xì)胞色素Bcl復(fù)合物活性，從而抑制線粒體的呼吸作用，阻斷電子傳遞，干擾真菌體內(nèi)的能量循環(huán)，抑制真菌的生長[3]。

甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥主要包括啶氧菌酯、肟菌酯、醚菌酯、嘧菌酯[4]、吡唑醚菌酯[5]和烯肟菌胺等十余個品種[6]。啶氧菌酯化學(xué)名稱為(E)-3-甲氧基-2-{2-[6-(三氟甲基)-2-吡啶氧甲基]苯基}丙烯酸甲酯，主要用于防治麥類葉面病害[7]，如葉枯病、葉銹病、穎枯病、褐斑病、白粉病等[8]，與現(xiàn)有其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑相比，對小麥葉祜病、網(wǎng)斑病和云紋病有更強的治療效果[9]。在中國，啶氧菌酯還用于水稻稻曲病等病害的防治，其使用范圍和使用量正逐步上升。目前，對啶氧菌酯檢測主要集中在殘留的檢測[1,10-13]，Gao等[9]利用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜，前處理采取改良的QuEChERs方法，同時檢測辣椒中啶氧菌酯和吡唑醚菌酯含量，回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均滿足分析要求。勞斐等[14]建立了黃瓜中啶氧菌酯殘留量的檢測方法，當(dāng)添加濃度在0.02 mg/kg～ 0.10 mg/kg水平時，回收率在88.2%～ 101.9%之間，RSD值為1.2%～ 2.6%，該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高、檢測限低。楊雅雅等[15]利用QuEChERs前處理，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用建立了蘋果中啶氧菌酯和四螨嗪的測定方法，簡單快速，具有很好的精密度及準(zhǔn)確度。無論是色譜法[16-17]還是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-10,13-15,18-20]的方法，都是針對啶氧菌酯殘留的檢測，基質(zhì)包括土壤和植株等等，制劑的有效成分檢測方法則報道較少。而隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和使用技術(shù)的發(fā)展，中國農(nóng)藥產(chǎn)品已由單一品種向復(fù)配農(nóng)藥轉(zhuǎn)化，且農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量也參差不齊，還有部分農(nóng)藥企業(yè)在產(chǎn)品中添加標(biāo)示外的農(nóng)藥成分，給檢測部門帶來了一定的困難。中國《農(nóng)藥管理條例》對假農(nóng)藥做了嚴(yán)格規(guī)定：農(nóng)藥所含有效成分種類與農(nóng)藥的標(biāo)簽、說明書標(biāo)注的有效成分不符，一律認(rèn)定為假農(nóng)藥[21]。所以，對制劑有效成分的檢測具有重要意義。本實驗擬解決的關(guān)鍵問題在于建立一種方法可以同時適用于啶氧菌酯懸浮劑（suspension concentrate，簡寫為SC）及水分散粒劑（water dispersable granule，簡寫為WG）中有效成分的檢測，采用反相高效液相色譜法，通過優(yōu)化流動相比例、波長掃描、純度檢驗等等，建立的方法完全滿足上述要求，用于具有靈敏度高，操作簡便的特點，同時，為國家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀：Aglient1260，二極管陣列監(jiān)測器(DAD)。色譜數(shù)據(jù)處理機或色譜工作站。色譜柱：250 mm×4.6 mm(i.d.)不銹鋼柱，內(nèi)裝Waters Symmetry-C18、5 μm 填充物。過濾器 ：濾膜孔徑約0.45 μm。微量進(jìn)樣器：50 μL。定量進(jìn)樣管：5 μL。KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，密理博純水器(Millipore,El Passo,TX,USA)。

1.1.2 試劑 乙腈：色譜純；水：新蒸二次蒸餾水或超純水；啶氧菌酯標(biāo)樣：已知啶氧菌酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%(TM standard)。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件 流動相:Ψ（乙腈:水）=80:20，經(jīng)濾膜過濾，并進(jìn)行脫氣；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：220 nm；進(jìn)樣體積：5μL。

1.2.2 測定步驟

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取0.05 g（精確至0.000 1 g）啶氧菌酯標(biāo)樣于100 mL容量瓶中，加入20 mL乙腈，超聲波振蕩5 min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。

（2）試樣溶液的制備

稱取含0.05 g（精確至0.000 1 g）啶氧菌酯的試樣于100mL容量瓶中，加入20mL乙腈，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，過濾。

（3）測定

在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰兩針啶氧菌酯峰面積相對變化小于1.2%時，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 吸收波長的選擇 啶氧菌酯分子內(nèi)含有不飽和的共軛雙鍵，所以在紫外區(qū)具有吸收，為了獲得啶氧菌酯的最大吸收波長，利用高效液相色譜配置的二極管陣列檢測器，在紫外區(qū)進(jìn)行全波長掃描(200～ 400 nm)。結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出啶氧菌酯的最大吸收波長約在220 nm，在該波長處靈敏度較高，干擾較少，能夠滿足分析的要求，故將檢測波長確定為220 nm。

圖1 啶氧菌酯的紫外光譜圖

2.1.2 色譜柱及流動相的選擇 根據(jù)啶氧菌酯的性質(zhì)，色譜柱選擇常用的C18反相柱。反相液相色譜最常用的溶劑包括甲醇、乙腈等等，雖然啶氧菌酯在甲醇中溶解度較大[22]，但是在波長220 nm的情況下，甲醇的紫外吸收對目標(biāo)物會產(chǎn)生干擾，所以綜合考慮選擇乙腈作為溶劑溶解樣品，并以乙腈和水作為流動相。隨著乙腈比例的增加，保留時間減小，最終的比例選擇（乙腈:水）=80:20，流速1.0 mL/min。該條件下，啶氧菌酯色譜峰峰形較好（圖2～ 圖3），與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時間較短。

圖2 啶氧菌酯水分散粒劑HPLC圖

圖3 啶氧菌酯懸浮劑HPLC圖

2.2 峰純度檢驗

在色譜分析中，色譜峰的純度鑒定對于復(fù)雜物質(zhì)的分析具有重要的意義[23]。利用高效液相色譜的二極管陣列檢測器（簡寫為PDA或者DAD）可以實現(xiàn)對峰純度的檢測，本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別啶氧菌酯。50%啶氧菌酯水分散粒劑和22.5%啶氧菌酯懸浮劑中的啶氧菌酯HPLC-PDA峰純度因子均大于950，啶氧菌酯不存在同分異構(gòu)體，所以有效成分處無其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。峰純度色譜圖見圖4～ 圖5。

圖4 50%啶氧菌酯水分散粒劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

圖5 22.5%啶氧菌酯懸浮劑HPLC-DAD峰純度色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線性范圍 按1.2.1標(biāo)樣溶液的制備方法配制5個不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液，分別標(biāo)記為STD1～ STD5。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，按照STD1～ STD5的順序測定每個溶液中啶氧菌酯的峰面積，取2次測定的平均結(jié)果。以啶氧菌酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，當(dāng)啶氧菌酯質(zhì)量濃度在100.1～ 1000.8 mg/L之間（進(jìn)樣體積5μL），與相應(yīng)的啶氧菌酯峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，計算得回歸方程為y=9827.8x+6154.3，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，完全可以滿足定量分析要求。

圖6 啶氧菌酯峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系圖

2.3.2 方法精密度試驗 精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或者相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，本實驗對同一種農(nóng)藥制劑進(jìn)行了5次測定，計算結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。按1.2.2試樣溶液的制備方法分別配制5個22.5%啶氧菌酯懸浮、5個50%啶氧菌酯水分散粒劑精密度溶液，分別標(biāo)記為SC-A1至SC-A5、WG-A1至WGA5。分別以STD-SC-A、STD-WG-A為標(biāo)樣溶液，在上述色譜操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、精密度溶液、精密度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定，結(jié)果見表1～ 表2。

農(nóng)藥測定和分析方法中，數(shù)據(jù)結(jié)果的合格性應(yīng)以修改的Horwitz公式(2(1-0.51ogC)×0.67)為依據(jù)[24]，RSD值小于這個修正值通常被認(rèn)為是合格的。從表1、表2可以看出，22.5%啶氧菌酯懸浮劑中啶氧菌酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果的RSD為1.31%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=2.09（其中C=0.2274），50%啶氧菌酯水分散粒劑中啶氧菌酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果的RSD為0.69%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.65，（其中C=0.5053），表明有效成分分析方法精密度的測定結(jié)果符合要求。

表1 22.5%啶氧菌酯懸浮劑中啶氧菌酯精密度試驗結(jié)果

表2 50%啶氧菌酯水分散粒劑中啶氧菌酯精密度試驗結(jié)果

2.3.3 方法準(zhǔn)確度試驗 利用在農(nóng)藥制劑中添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法來驗證方法的回收率，分別稱取含0.025 g（精確至0.000 1 g）啶氧菌酯的22.5%啶氧菌酯懸浮劑、50%水分散粒劑于100 mL容量瓶中，再分別加入啶氧菌酯標(biāo)樣0.025 g（精確至0.00001 g），按試樣溶液的制備方法配制5個有效成分準(zhǔn)確度溶液，標(biāo)記為SCB1～ SC-B5、WG-B1～ WG-B5。以STD-B為標(biāo)樣溶液，在上述液相色譜操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，按照標(biāo)樣溶液、準(zhǔn)確度溶液、準(zhǔn)確度溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定，結(jié)果見表3～ 表4。

表3 22.5%啶氧菌酯懸浮劑回收率試驗結(jié)果

表4 50%啶氧菌酯水分散粒劑回收率試驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明，22.5%啶氧菌酯懸浮劑中啶氧菌酯平均回收率為100.64%，50%啶氧菌酯水分散粒劑中啶氧菌酯平均回收率為99.74%，具有良好的準(zhǔn)確度。

2.3.4 不同實驗室方法驗證 為了驗證建立的方法在不同實驗室的適用性，分別在3個不同實驗室進(jìn)行了方法驗證實驗，實驗結(jié)果見表5。從統(tǒng)計結(jié)果看，22.5%啶氧菌酯懸浮劑、50%啶氧菌酯水分散粒劑重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.8052%、0.6003%，再現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDR分別0.8560%、1.5625%，都小于相應(yīng)的Horwitz公式理論計算值，表明不同單位間的檢測結(jié)果符合性良好，本研究報告建立的啶氧菌酯液相色譜分析方法可以滿足日常檢測工作需要。

表5 不同實驗室方法驗證結(jié)果統(tǒng)計表

3 結(jié)論與討論

目前的研究結(jié)果主要集中在啶氧菌酯殘留的檢測方面，對于農(nóng)藥制劑的有效成分報道較少，采用同一種方法進(jìn)行啶氧菌酯兩種制劑有效成分的測定則未見報道。本研究利用高效液相色譜-紫外檢測器，乙腈溶解樣品，檢測波長220 nm，乙腈-水作為流動相，等度洗脫，建立了在同一條件下啶氧菌酯水分散粒劑及懸浮劑的測定方法。

高效液相色譜測定波長一般利用二極管陣列監(jiān)測器進(jìn)行全波長掃描，得出樣品溶液的最大吸收波長，除此之外，還要避開其它物質(zhì)的干擾。本實驗選用220 nm作為測定波長，在此波長處響應(yīng)值最高，干擾較小。并進(jìn)行了色譜峰特異性檢驗（純度檢驗），多數(shù)情況下，純度檢驗可以輔助人們進(jìn)行方法開發(fā)[26]。不同物質(zhì)具有不同的紫外吸收光譜，但是對于具有手性對映異構(gòu)體的物質(zhì)，無法實現(xiàn)色譜峰純度的檢測。鑒于啶氧菌酯不存在手性異構(gòu)體，可以通過純度檢查色譜峰是否為單一物質(zhì)峰。本實驗中峰純度均滿足要求。

農(nóng)藥制劑有效成分的提取一般會考慮各方面的影響因素[25]，首先根據(jù)農(nóng)藥在不同溶劑中的溶解度，其次要兼顧液相色譜所用的流動相及吸收波長。本實驗選擇乙腈作為提取溶劑溶解樣品。實際上，啶氧菌酯在甲醇中的溶解度高于乙腈，而且甲醇的成本相對較低，所以，首先選用甲醇溶解樣品，但是由于甲醇存在干擾，色譜峰峰形較差，而且實驗中選用的波長為220 nm，為了減小對目標(biāo)物的干擾，最終選擇乙腈溶解樣品。在反向色譜柱方法開發(fā)中，廣泛使用的兩種常見的流動相是甲醇和乙腈。用甲醇做流動相，紫外波長需要設(shè)置大于230 nm，而乙腈則大于210 nm即可。另外從色譜峰形上來看，乙腈的粘度較甲醇小，從速率方程角度說，流動相傳質(zhì)阻抗小，有利于柱效提高，色譜峰較窄，峰形較好。啶氧菌酯保留時間在6 min左右。本方法具有操作簡單、節(jié)省時間、靈敏度高、準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性好等優(yōu)點，目前正在探索多種農(nóng)藥制劑有效成分的聯(lián)合檢測方法，以期獲得更高的效率。

本研究建立的啶氧菌酯的測定方法，兩種制劑中啶氧菌酯的回收率分別為100.64%、99.74%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值分別為1.31%、0.69%。準(zhǔn)確度、精密度、RSD值均滿足分析要求，適用于啶氧菌酯水分散粒劑及懸浮劑中有效成分的測定。