長枝木霉TS-1的分離鑒定、拮抗作用及固體發酵條件初探

張小杰，周天旺，王春明，郭 成

（1甘肅農業大學植物保護學院，蘭州730070；2甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州730070）

0 引言

近年來，化學農藥和化肥的長期大量使用，使得病原菌抗藥性迅速增強，防效降低[1]，同時對土壤、水質乃至生態環境造成了非常嚴重的負面影響[2]，給植物的安全帶來巨大隱患。因此，生防菌劑便以其風險低、環境相容性好的優點凸顯了出來[3]。木霉屬(Trichoderma Pers.)真菌作為一種適應性強、抗菌譜廣、拮抗機制多樣化的生防菌，在自然界廣泛分布和存在[4-5]。目前已有多種木霉菌被用于生物防治，國內外研究拮抗作用較好的木霉菌通常為哈茨木霉，綠色木霉和長枝木霉。其中，利用長枝木霉可防治多種病害，包括土傳病害、林木病害及葉部病害等，均在田間取得了良好的防效[6-9]。其對可可豆[6]、黃瓜[9]、牧草[10]、小麥[11]、玉米[12]等多種植物也具有促生作用，通過改善植物的生長狀況，提高植物的抗病性。另外，木霉菌培養條件簡單，繁殖速度快，符合工業化生產的需要，被公認為可取代化學試劑，是開發生防制劑防治植物病害的有力競爭者[13]。

現行的木霉菌劑以收獲分生孢子為主，木霉大規模的發酵生產對其在生物防治中的應用具有重要的現實意義。獲得木霉菌大量培養物的最優發酵條件是該菌大規模應用的前提[14]，故發酵方法的選擇在一定程度上決定了菌株的生防能力。與傳統的液體發酵相比，固體發酵經濟實用，目前己成為國內外重要的研發生產工藝[15]。其所獲得的孢子濃度高、質量好，產生的孢子對干旱等不利條件的抗性和穩定性更強[16]，且發酵設備簡單易操作，發酵原料來源豐富、成本低廉。發酵產品可直接制成菌劑，易保存和運輸，貯存期長[17]，一方面可作為生物肥料，直接播撒于田間，方便農戶使用[15]，另一方面還可以制成高效的液體劑型的生物農藥，達到液體發酵液的效果[18-19]。

目前在生產中使用的木霉商品化制劑已達50多種，使用的含木霉成分生物制劑達到100多種[20-21]。菌株主要以哈茨木霉菌和少量的綠色木霉菌為主，對長枝木霉的研究相對較少[22]。因此，本研究對分離自甘肅省景泰縣馬鈴薯植株根際土壤的木霉菌株TS-1進行了鑒定，抑菌效果、促生作用及固體發酵條件的初步摸索，旨在為該菌株進一步的擴大培養和有效利用提供科學依據和技術支撐，為西北地區的生物防治提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株TS-1分離自甘肅省白銀市景泰縣條山鎮馬鈴薯植株根際土壤。供試靶標病原菌6株，分別為茄病鐮孢(Fusarium solani)、接骨木鐮孢(F.sambucinum)、禾谷鐮孢(F.graminearum)、尖孢鐮孢(F.oxysporum)、擬輪枝鐮孢(F.verticillioides)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，均由甘肅省農業科學院植物保護研究所植物病理研究室提供。

1.2 菌株TS-1的鑒定

1.2.1 形態學鑒定 將菌株TS-1活化于PDA平板上，在25℃恒溫黑暗條件下培養3天后，再分別轉接于PSA和SNA平板，設3次重復。根據文獻[23]觀察菌落形態，測量48 h的菌落生長直徑，計算生長速率，并且觀察子實體的形態特征，進行形態學分類鑒定。

1.2.2 分子生物學鑒定 真菌DNA的提取，采用上海生工生物工程技術服務有限責任公司試劑盒進行。引物選用 EF-1α[24]：EF1-728F：5′-CATCGAGAAGTTCGA GAAGG-3′和 EF1-986R：5′-TACTTGAAGGAACCC TTACC-3′，由上海生工北京分公司合成。PCR擴增產物送交上海生工北京分公司測序。將測序結果與NCBI基因庫中已登錄的相關木霉EF-1α基因序列進行BLAST比對，利用DNA Star軟件構建菌株TS-1的系統發育樹。

1.3 菌株TS-1對植物病原菌的抑菌效果

以菌株TS-1為拮抗待測菌株，其他6種植物病原真菌為靶標菌，參考文獻[25-26]，采用對峙培養法進行抑菌效果的測定。

1.4 菌株TS-1對小麥的促生作用

1.4.1 孢子懸浮液的制備 參考文獻[10]，配置濃度為1×108cfu/mL的孢子懸浮液原液，再依次稀釋成1×107、1×106、1×105cfu/mL的孢子懸浮液備用。

1.4.2 種子形態學指標測定 挑選健康和大小均一的小麥種子（品種：輝縣紅）。參考文獻[10]，進行種子形態學指標的測定。試驗以無菌水處理作為對照，共設置1×107、1×106、1×105cfu/mL 3個處理和1個對照，每個處理和對照重復4次。7天后統計種子發芽數和根數，測量芽長和根長，并稱量芽鮮重和根鮮重。

1.5 菌株TS-1固體發酵條件初探

以產孢量為指標，采用單因素實驗篩選菌株TS-1固體發酵培養基的主要成份配比、疏松值、碳源和氮源，確定最適因子。

1.5.1 固體發酵培養基主要成份秸稈與麩皮配比的篩選 主要成份秸稈（玉米）與麩皮（小麥）按體積比為10:0，9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，0:10配制7種培養基，每處理重復3次。每200 mL培養瓶中裝入50 mL培養基，初始含水量為40%。滅菌后，接入TS-1菌餅3塊，25℃恒溫發酵5天。取5 g固體發酵物于45 mL無菌水中，攪拌均勻，稀釋至適當倍數，吸取100μL均勻涂布于含300μg/mL鏈霉素的PDA平板上。25℃恒溫黑暗培養2天，記錄平板上萌發的孢子數。篩選出最佳的主要成份配方比例。

1.5.2 固體發酵培養基疏松值的篩選 在發酵基礎培養基中分別按體積比40%添加浸泡過夜的大麥、小麥、高粱、玉米，每處理重復3次。處理方法同1.5.1，篩選出最佳的疏松值。

1.5.3 培養基中大麥含量對菌株TS-1產孢量的影響

在發酵基礎培養基中分別按體積比10%、20%、30%、40%、50%添加浸泡過夜的大麥，每處理重復3次。處理方法同1.5.1，篩選出最佳的疏松值（麥粒）含量。

1.5.4 培養基中不同碳、氮源對菌株TS-1產孢量的影響 在發酵基礎培養基中分別添加10%碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖）和氮源（硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉），每處理重復3次。處理方法同1.5.1，篩選出最佳碳、氮源。

1.6 數據分析

采用Excel 2010進行數據處理，并采用DPS 2005軟件進行單因素方差分析，Duncan氏新復極差法進行處理間差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 菌株TS-1的形態特征描述

該菌株在PSA平板培養基上生長較快，產分生孢子較早且多，也能產生厚垣孢子。該菌株產孢簇為松散羊毛狀到緊實的皰狀結構，分生孢子梗具有較簡單的分枝系統，通常呈直角的1～ 2次分枝，單生或有時成對。瓶梗不規則地在側面分布，時常單生，安瓿形或柱形，基部常縊縮但不明顯；分生孢子單細胞、長方形到橢圓形、綠色、光滑。根據菌株TS-1的培養特性和形態特征，鑒定該菌株為長枝木霉(T.longibrachiatum)。

2.2 EF-1α基因序列分析

經測序得到的序列與NCBI基因庫中已有的木霉菌EF-1α基因序列進行比對，發現菌株TS-1與GenBank上登錄的長枝木霉(EU280033)、長枝木霉(AY865640)和長枝木霉(DQ125467)的菌株同源性均達99%以上，其中與長枝木霉(DQ125467)同源性達100%（圖1）。系統發育分析所用的相關長枝木霉菌株背景信息見表1。因此，結合形態學特征，將菌株TS-1鑒定為長枝木霉(T.longibrachiatum)。

圖1 基于EF-1α建立的菌株TS-1的遺傳聚類分析圖譜

表1 相關長枝木霉菌株的背景

2.3 菌株TS-1對植物病原菌的抑菌效果

結果表明：對峙培養5天時，TS-1對6種病原菌的抑菌率達52.69%～ 73.81%，拮抗系數分別表現為Ⅱ或Ⅱ～ Ⅲ或Ⅲ，其中對茄病鐮孢、接骨木鐮孢和灰葡萄孢有很強的抑制作用，抑菌率均高達70%以上，3個菌株之間拮抗效果差異不顯著(P＞0.05)，但與禾谷鐮孢、擬輪枝鐮孢和尖孢鐮孢之間拮抗效果差異顯著(P＜0.05)，抑菌率在50%～ 70%之間。上述6種病原菌明顯受到長枝木霉菌株TS-1的抑制，其菌落指向木霉菌的半徑明顯低于對照半徑，二者接觸后，病原菌菌落長勢被削弱，與木霉菌處于對抗僵持狀態，部分病原菌交界處木霉菌邊緣變得厚實。

表2 TS-1對6個植物病原菌的拮抗作用

2.4 菌株TS-1對小麥的促生作用

與對照相比，長枝木霉菌株TS-1 3個濃度的孢子懸浮液對小麥種子發芽率無顯著差異，對小麥的根長和根冠比呈顯著差異(P＜0.05)，有一定的促生作用。其中濃度為1.0×106cfu/mL和1.0×107cfu/mL的孢子懸浮液對小麥各形態學指標（除發芽率外）的影響差異顯著，有明顯的促生作用。

2.5 TS-1固體發酵條件篩選結果

2.5.1 固體發酵培養基主要成份秸稈與麩皮配比的篩選 由圖2表明，菌株接種到不同比例的秸稈與麩皮中，其產孢量差異很大。秸稈:麩皮=9:1時，發酵效果較好，產孢量最高，其對數值達到7.48，與其他各處理間差異顯著(P＜0.05)。而在秸稈:麩皮=5:5的培養基中產孢量對數值僅為6.10，其與全麩皮培養基中的產孢量對數值差異不顯著(P＞0.05)。因此，選擇秸稈:麩皮=9:1為菌株固體發酵培養基主要成份的最佳配比。

圖2 不同配比的秸稈與麩皮對菌株TS-1產孢量的影響

2.5.2 固體發酵培養基疏松值的篩選 菌株接種到大麥、小麥、高粱、玉米分別作疏松值的固體發酵培養基中，實驗結果如圖3所示，以上4種疏松值對菌株TS-1產孢量對數值的影響差異不顯著(P＞0.05)。因此，選擇產孢量相對較高的大麥作為菌株固體發酵培養基的疏松值。

圖3 不同疏松值對菌株TS-1產孢量的影響

2.5.3 培養基中大麥含量對長枝木霉菌株TS-1產孢量的影響 菌株在不同大麥含量的培養基中產孢情況見圖4，在供試體積范圍內，隨著大麥含量的增加，長枝木霉菌株TS-1產孢量逐漸降低。當麥粒添加量為50%時，產孢量最少，其對數值為7.25，與其他各處理間差異顯著(P＜0.05)。而麥粒添加量在10%、20%和30%之間差異不顯著(P＞0.05)，選擇添加10%的大麥粒，產孢量相對較高。

圖4 不同大麥含量對菌株TS-1產孢量的影響

表3 不用濃度的長枝木霉菌株TS-1對小麥形態學指標的影響

2.5.4 培養基中碳源和氮源對長枝木霉菌株TS-1產孢量的影響 菌株TS-1在3種碳源和氮源條件下均能產孢（圖5，圖6）。當添加乳糖時，產孢量最大，其對數值達到7.56，與添加蔗糖條件下產孢量對數值之間差異不顯著(P＞0.05)，但與添加葡萄糖條件下產孢量對數值差異顯著(P＜0.05)。當添加硫酸銨時，產孢能力最強，產孢量最大，其對數值達到6.72，但經方差分析可知3種氮源產孢量之間差異不顯著(P＞0.05)，說明氮源對菌株TS-1的產孢量影響不大。

圖5 不同碳源對菌株產孢量的影響

圖6 不同氮源對菌株產孢量的影響

3 討論與結論

每種木霉在生防功能與代謝產物上都不盡相同，因此，準確的分類鑒定對其在農林生產中的應用具有 重要意義。在研究木霉菌株生防潛力之前必先清楚其分類地位，以免造成混淆以及在制劑生產過程中不必要的煩擾[27]。通過形態學來確定木霉菌的分類地位向來是研究者的一個難題，因為同一屬的不同菌種，特別是相近種在形態學上的差別不大。單從形態特征等方面去確定木霉菌的種間分類地位，其鑒定結果的準確性很難令人信服。翻譯延伸因子1A(elongation factor 1 alpha,EF-1α)是一個非常重要的多功能蛋白，其序列在不同物種中高度相似，被廣泛地用來進行種系發生分析[28]。研究表明利用EF-1α對木霉菌進行種間的分類鑒定是穩定可行的，崔巖等[26]利用延伸因子對中國木霉新記錄種俄羅斯木霉(T.rossicum)進行了分類學地位確定。因此，本研究在形態學比對的基礎上，采用EF-1α基因序列分析作為輔助鑒定手段，提高了菌株TS-1鑒定的準確性。

國內外大量的研究結果表明，木霉菌的抑菌作用具有廣譜性，集定殖能力強和多種拮抗機制并存等優勢。本試驗同時針對禾谷鐮孢、尖孢鐮孢、擬輪枝鐮孢、茄病鐮孢、接骨木鐮孢和灰葡萄孢等6種病原真菌采用對峙培養法進行拮抗作用的測定，均有較好的抑菌效果。木霉生長速度顯著快于其余病原菌，在營養及空間上主要通過分生孢子梗與氣生菌絲的擴展達到占領生存空間的目的。由于不同的病原菌菌絲生長能力與產孢時間不完全相同，長枝木霉TS-1對幾種病原菌的抑菌作用效果稍有不同。其中，對茄病鐮孢和接骨木鐮孢有較好的抑制作用，與崔巖等[26]報道俄羅斯木霉GAU1-X-2的研究結果較一致，這可能與2個菌株均來源于同一地區、同一作物根際土壤有關。關于長枝木霉TS-1對灰葡萄孢的拮抗作用，與前人研究結果基本一致[29-30]。本研究還發現該菌株對小麥形態學指標具有較明顯的促生作用，與Zhang等[11]研究結果一致。在小麥苗期，可通過噴施該菌株的孢子懸浮液增大其根冠比，促進植物地下部分根系生長，進而促進地上部分莖、葉生長量。

大規模應用木霉固體發酵產物防治病害，首先必須篩選獲得既高效又經濟的培養基質，培養基質是影響木霉產孢量的重要因素。本試驗通過單因素實驗優化木霉發酵條件，選擇麩皮等農業廢棄物，可刺激木霉菌在土壤中的增殖。添加大麥粒作為疏松值，可增加培養基的透氣性，有利于產孢[31]。篩選出的培養基中添加乳糖與蔗糖時，產孢量最大。但蔗糖較乳糖廉價易得，作為碳源用于發酵更具可行性。篩選出的培養基中分別添加硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉3種無機氮源時，硫酸銨、硝酸銨的產孢能力均強于硝酸鈉，但三者對產孢量的影響不顯著，這與前人的研究結果一致[32]，木霉對氮的適應性很強，但對銨鹽的利用優于硝酸鹽。上述試驗說明長枝木霉TS-1所使用發酵材料較為廉價易得，可進行大量擴繁，投入生產，具有制成生防制劑的潛力。

長枝木霉TS-1是從甘肅馬鈴薯連作田根際土壤中分離得到的一株具有良好抑菌促生作用的菌株，其對禾谷鐮孢、尖孢鐮孢、擬輪枝鐮孢、茄病鐮孢、接骨木鐮孢和灰葡萄孢等6種病原真菌的抑菌率均在50%以上，對小麥形態學指標具有較明顯的促生作用，所使用的固體發酵材料廉價易得，產孢量大。綜上，該菌株具有較好的生防應用潛力。但田間情況復雜，木霉群體的定殖能力和生存能力受到一定的限制，其生防效果不穩定。因此，有關該菌株對植物病原菌的作用機理以及在田間的定殖能力和防治效果還有待于進一步試驗和研究。