四川茂縣花椒根腐病病原菌的分離與鑒定

李志克，唐 蓉，黃小琴，張 蕾，張重梅，鮮赟曦，何天偉，周西全，劉 勇，楊瀟湘

（1四川省農業科學院植物保護研究所，農業農村部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，成都610066；2茂縣林業和草原局，四川茂縣623200；3營山縣農業農村局，四川營山637700）

0 引言

花椒(Zanthoxylum bungeanum)屬蕓香科、花椒屬多年生香料和油料樹種，果實含有揮發性油和脂肪，可作食品香料和香精原料，果實還是調味佳品，并具有醫療作用，因此受到了廣泛關注[1]。在中國四川、陜西、云南、甘肅、貴州、河北、湖北、湖南、安徽等省栽培面積較大，產量高[2]。四川省阿壩藏族羌族自治州茂縣花椒栽培歷史悠久，依托得天獨厚的岷江干旱河谷氣候條件，形成茂縣大紅袍花椒油重粒大、色澤紅亮、芳香濃郁、醇麻可口的獨特風味，在市場上享有較高聲譽，已成為中國國家地理標志產品和茂縣高半山老百姓脫貧奔康的重要農業支柱產業[4-5]。然而，花椒樹在生長過程中極易受到病蟲害的侵襲，加之近年來受市場因素的影響，茂縣花椒栽培面積增加，一度陷入粗放管理和掠奪式生產階段，茂縣花椒病蟲害發生日趨嚴重。其中，花椒根腐病在茂縣發生尤為嚴重，新椒園發病率為20%左右，成年椒園病株率達35%以上，且為害程度逐年上升，椒農損失巨大。受害花椒根部變色腐爛，有異臭味，根皮與木質部脫離，木質部呈黑色。地上部分葉形小而色黃，枝條發育不全，造成大批椒樹死亡，嚴重影響茂縣花椒的產量和品質，甚至造成毀園[5-6]。此外，該病的頑固性土傳特性，導致新栽植花椒易感菌死亡。老椒園不能繼續栽植花椒是茂縣花椒產業難以持續發展的一大難題[5]。研究花椒根腐病病原菌的歸屬種類，是科學有效防控該病害的首要條件。目前關于花椒根腐病病原鑒定的研究相對較少。1994年，朱天輝和陳第先通過病原分離和致病力測定，分離得到花椒根腐病的致病菌，并對病原菌分生孢子的形狀、大小等形態特征進行觀察測定，首次發現引起四川漢源花椒根腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)[7]。2006年，李智敏等人亦對云南省昭通市花椒根腐病的病原進行分離培養和形態學鑒定，結果表明云南花椒根腐病的致病菌為茄形鐮刀菌(F.solani)，與朱天輝等記載的腐皮鐮刀菌相一致[8]。以上關于花椒根腐病病原鑒定的研究皆是基于形態學觀察的鑒定手段。然而，鐮刀菌屬是一個龐大的屬，其種類繁多，且部分鐮刀菌存在多個專化型，種間形態學特征較為接近，僅以形態特征對鐮刀菌進行種類鑒定是不夠準確的[9]。本研究通過茂縣花椒根腐病病根采集、病原分離和純化、致病力測定，并結合傳統的形態學鑒定和基于核糖體轉錄間隔區序列(ITS)和延長因子基因序列(tef1)的分子鑒定，準確確定了茂縣花椒根腐病病原的分類地位，旨在為科學有效防治茂縣花椒根腐病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病原微生物的分離與純化

花椒根腐病病根樣品采自四川省阿壩州茂縣溝口鎮與疊溪鎮花椒園，并記錄癥狀和拍照。將花椒病根表面土壤清洗干凈后，用刀片將其切成約5 mm×5 mm的病根組織，病原菌的分離方法采用組織分離法。進行分離培養。待菌落形成并產孢后采用孢子直接挑取法進行病原菌純化得到單孢菌株。將單孢菌株轉入PDA試管斜面培養基，置25℃光照培養箱進行培養，待斜面長滿后置于4℃保存備用。

1.2 致病性測定

一年生花椒幼苗根系作切傷處理后栽種在滅菌營養土中。將濃度為1×107個/mL病菌孢子懸浮液灌注在花椒根部附近的土壤中，20～ 50天后觀察病情，發病后再次通過組織分離法分離病原菌，若分離得到的病原物與原接種菌株一致，則確定該病原物為花椒根腐病致病菌，完成柯赫氏法則的驗證[8]。

1.3 病原菌形態觀察

將病原菌置于PDA平板培養基上進行活化，用直徑為5 mm打孔器打取邊緣菌絲，接種于PDA培養基上，置25℃光照培養箱進行培養，觀察菌落形態、色澤及產孢情況等。在顯微鏡下觀察孢子的類型、大小等特征。

1.4 病原菌的分子鑒定

利用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌的DNA，用引物ITS1/ITS4[10]和EF1/EF2[11]擴增根腐病菌的核糖體轉錄間隔區序列(ITS)和延長因子基因(tef1)。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。將測序得到的序列在NCBI進行BLAST序列比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下載相似性高的序列，使用采用MEGA7軟件分析生成系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 花椒根腐病病害癥狀

對茂縣溝口鎮與疊溪鎮的花椒根腐病發生情況進行了調查，花椒根腐病在成年椒園中發生普遍，病株率達35%以上，其癥狀表現為根部變色腐爛，有異臭酸味，根皮易脫落，皮下木質部呈現黑色（圖1A），地上部分的葉片小，葉片部分失綠。為害重時，造成整株植株死亡，極大的影響了茂縣花椒的品質及產量。

2.2 病原菌的致病性測定

根據常規分離純化法，得到菌落形態一致的分離物，并通過孢子直接挑取法獲得單孢菌株2020M1。采用盆栽接種法接種菌株2020M1的孢子懸浮液，20天后有傷口的根系開始變黑；30天后花椒地上部分出現萎焉，根系表皮脫落、根部變黑腐爛，與椒園花椒根腐病發病癥狀相似；40天后在莖桿基部可見病原菌菌絲（圖1B、C），人工接種的花椒根腐病發病率為100%。對照的花椒苗根部完好，無相應病害癥狀（圖1D）。通過對接種發病的花椒病根進行病原分離，得到了與原接種病菌菌落形態一致的分離物，由此確定該分離菌株與原接種菌株一致，完成柯赫氏法則驗證。

圖1 花椒根腐病危害癥狀

2.3 病原菌形態觀察

花椒根腐病致病菌株在PDA培養基上生長迅速，菌落呈圓形，菌絲初為灰白色，后為蘭褐色或紫紅色，表面稀疏。大型分生孢子鐮刀形，0～ 3個隔膜，大小為(24.7～ 46.0)μm ×(4.5～ 7.4)μm；小型分生孢子呈腎形，0～ 1個隔膜，大小為(8.4～ 20.6)μm ×(3.2～ 6.5)μm（圖 2）。通過病原菌形態學觀察，確定該病原菌屬于鐮刀菌屬(Fusarium)真菌。

圖2 花椒根腐病病原菌形態特征

2.4 病原菌分子鑒定

利用ITS、tef1基因特異引物對分離得到的根腐病致病菌株進行PCR擴增，將測序獲得序列與GenBank中相關數據進行相似性分析。選取不同種類鐮刀菌的ITS和tef1序列，首位相連，采用MEGA 7軟件分析生成多基因系統發育樹。由系統發育圖可知，茂縣花椒根腐病病原分離物2020M1與腐皮鐮孢菌(F.solani)W5-3、4100、FJAT-31354處于同一分支，親緣關系最近（圖3）。因此，聯合花椒根腐病病原菌的菌落形態特征和分子鑒定結果，將引起茂縣花椒根腐病的病原菌確定為腐皮鐮孢菌(F.solani)。

圖3 基于ITS和tef1序列構建的2020M1菌株系統發育進化樹的病原菌種類進行

3 討論與結論

本研究通過觀察四川茂縣花椒根腐病的危害癥狀和病原菌的形態學特征，初步確定引起茂縣花椒根腐病的病原菌為鐮刀菌屬(Fusarium)真菌。為進一步明確病原，采用ITS、tef1基因特異引物對病原進行PCR擴增，并構建系統發育樹。結果表明，引起茂縣花椒根腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌(F.solani)。

鐮刀菌屬是分布十分廣泛、非常龐大的一個屬，不僅種類繁多、部分鐮刀菌存在多個專化型，以及鐮刀菌種間差異微小，加上鐮刀菌屬真菌在生長過程中形態變異較大，傳統的花椒根腐病病原菌鑒定方法僅僅依靠病原菌分生孢子的形狀、大小等形態特征，很難準確的區分種類[9,12-13]。而花椒根腐病傳染性和致病性強且不易清除，準確確定其病原對該病的防控具有重大的意義。近年來，多基因分子鑒定的方法在鐮刀菌種類鑒定上應用廣泛，可以準確分類。目前應用于鐮刀菌鑒定常用的基因位點主要有ITS、tef1、β-tubulin、28S rDNA等[14]。如唐貴婷等[15]基于ITS基因序列和tef1基因序列相結合確定引起重慶南蒼術根腐病萎蔫病現象的病原菌是腐皮鐮孢菌(F.solani)。曹瑱艷等[16]同樣依據ITS基因序列和tef1基因序列相結合，確定厚垣鐮刀菌(F.chlamydosporum)為浙江省金華市武義縣鐵皮石斛根腐病的主要致病菌。朱孟烽等[9]采用ITS、tef1、βtubulin和28S rDNA四個基因位點證實咖啡腐皮鐮孢黑果病病原菌為(F.solani)。本研究采用形態學觀察為輔助、結合ITS和tef1基因序列的分子鑒定，構建多基因系統發育樹，最終準確確定引起茂縣花椒根腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌(F.solani)。

花椒根腐病病原菌的分離與準確鑒定為該病害的防控提供了理論基礎，但花椒根腐病的發生流行規律、病原菌的生物學特性和侵染循環等是開展監測預警及其有效防控的前提條件，還需進一步研究明確。此外，腐皮鐮孢菌寄主范圍廣泛，除了造成多種植物的根腐病[15]、莖腐病[17-18]外，還可以侵染引起咖啡[9]、桃子[19]和香蕉[20]等的果腐病，造成芒果[21]、茶葉[22]、刺桐[23]等的葉斑和枯萎病。本研究鑒定的花椒根腐病病原菌株2020M1的寄主范圍如何，是否也可侵染其他植物，造成根腐病、果腐病等病害？還得進一步研究，以便為病害的進一步防控和植物合理布局提供依據。

綜上，本研究通過對采自四川茂縣的花椒根腐病病根進行病原菌分離純化、柯赫氏法則驗證、形態學觀察與基于ITS和tef1基因序列的分子鑒定相結合，構建多基因系統發育樹，確定引起茂縣花椒根腐病的病原菌為腐皮鐮孢菌(F.solani)。