藻膽蛋白源生物活性肽研究進展

李富強，張廷新，李曉杰，朱麗萍，顏世敢

（齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東省微生物工程重點實驗室，濟南250353）

0 引言

藻膽蛋白(Phycobiliprotein)是存在于微藻、藍藻和一些真核藻類中的天然捕光色素蛋白。根據其所含的色基類型及其吸收光譜的不同，藻膽蛋白可分為藻藍蛋白(Phycocyanin，PC)、藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)、別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)和藻紅藍蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)四大類[1]。藻膽蛋白呈水溶性，無毒，呈現鮮艷的色澤，能發射明亮的熒光，具有抗氧化、抗輻射、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、調節免疫和保護神經等多種生物學活性，可用作食品或化妝品的天然色素、抗氧化劑、光敏治療劑、熒光檢測試劑、免疫增強劑、腫瘤抑制劑、抗病毒藥物等，應用前景廣闊。

生物活性肽是對生物體具有抗氧化、降血壓、降血脂、降膽固醇、免疫調節、抗菌、抗炎、抗癌和促進礦物質吸收等生理調節功能的多肽[2]。藻膽蛋白一級結構中的一些氨基酸序列，通常在蛋白質內部不起作用，但經水解后會被釋放出來，對人體健康發揮有益作用。藻膽蛋白源生物活性肽是指藻膽蛋白經蛋白酶水解后得到小分子肽，一般由2～ 10個氨基酸殘基組成，相對分子質量常低于3 kDa，具有比藻膽蛋白更高的生物學活性。

研究者很早就注意到藻膽蛋白酶解產物的活性。范敏[3]發現胰蛋白酶酶解藻藍蛋白的產物對人宮頸癌HeLa細胞株生長具有抑制作用。馬瑩[4]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶先后酶解藻膽蛋白，從酶解產物中獲得分子量小于3 kDa、具有ACE抑制活性的組分。Martínez-Palma等[5]通過胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解藻膽蛋白得到具有抗氧化能力的酶解產物。早期的研究都未分離純化出具有活性的多肽序列。因此，對藻膽蛋白源生物活性肽的結構、功能有待深入研究。

本文綜述了藻膽蛋白源生物活性肽的類型、結構及功能，期望為藻膽蛋白源生物活性肽的研發、應用提供支撐。

1 藻膽蛋白源抗氧化肽

人體的衰老以及許多疾病（如關節炎、動脈硬化、冠心病、神經性疾病和癌癥等）都與體內產生的自由基有關[6,7]。自由基可摧毀細胞膜，使細胞不能吸收營養物質，不利于代謝產物的排出，喪失對細菌和病毒的抵御力，導致免疫力低下、疲勞和器官病變等[8]。

食品變質是由于脂質的氧化或酸敗，形成不需要的脂質過氧化物而引起的。

目前在食品和制藥工業中，丁基羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、丁基羥基甲苯(BHT)和沒食子酸丙酯(PG)等人工合成抗氧化劑已被用于延緩氧化過程。由于潛在的健康問題，必須嚴格控制人工合成抗氧化劑的使用[9]。尋找安全、天然抗氧化劑替代人工合成抗氧化劑在食品工業中顯得尤為重要[10]。

具有疏水性的氨基酸是良好的質子供體和金屬離子螯合劑。酸性、堿性和芳香族氨基酸也有助于去除金屬離子，特別是脯氨酸(Pro)對多肽清除自由基特別重要[11]。在抗氧化肽中，天冬酰胺(Asn)殘基同樣較為常見，例如：ILGATIDNSK[12]、EQEEEESTGRMK[13]、VNLTPCEKHIME和LTPCEKHIME[14]等。在藻紅蛋白[15–18]和藻藍蛋白[19–22]中含有較多疏水和芳香族的氨基酸殘基，在體內、外的抗氧化測定中表現出顯著的氧自由基清除能力。EUN-YOUNG KIM等[23]利用雙向電泳和ESI-Q TOF MS/MS從條斑紫菜藻紅蛋白中鑒定了13種多肽(PBP1-PBP13)，并在HepG2細胞模型上檢測了13種多肽對活性氧生成的抑制作用。結果顯示PBP2(RYVSYALLAGDPSVLEDRC)在濃度為0.1～ 1 μg/mL時可使活性氧(ROS)產量比陽性對照降低50%以上，顯著降低了H2O2介導的HepG2細胞的氧化應激，PBP2通過上調p-Nrf2/SOD的表達來抑制ROS的產生。余頡等[24]用蛋白酶K消化螺旋藻，經過超濾、凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜分離得到一種新的抗氧化肽，ESI-MS鑒定序列為PNN。在濃度為100 μg/mL時，其對DPPH的清除率為81.44%，與谷胱甘肽(82.63%)相近，超氧陰離子、羥自由基的清除能力和SOD活性均顯示出良好的抗氧化能力。

2 藻膽蛋白源抗炎肽

炎癥反應是指機體組織受損傷或異物入侵時發生的以防御為主的反應過程，嚴重的炎癥反應可從局部的炎癥病灶蔓延，引起敗血癥，最終導致死亡。臨床應用的抗炎藥物大多都有較嚴重的不良反應，如損傷機體組織器官和免疫抑制作用等。因此研發有效、毒副作用低的抗炎藥物尤為重要。具有抗炎活性的多肽通常氨基酸序列中富含亮氨酸(Leu)、絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)和精氨酸(Arg)等疏水性氨基酸殘基和帶正電荷的氨基酸殘基，這些氨基酸殘基對多肽的抗炎活性具有重要影響[25]。藻膽蛋白具有抗炎作用[26]。Daeyoung Lee等[27]利用嗜熱蛋白酶(Thermolysin)消化掌狀紅皮藻的水提物得到酶解水提物(d-DWE)。在用脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥模型上，巨噬細胞中NO、TNF-α和IL-6的產生隨d-DWE濃度的增加而顯著降低，d-DWE抑制NO的最低作用濃度為100 μg/mL，對TNF-α和IL-6的抑制作用最低濃度為50 μg/mL。d-DWE濃度為250 μg/mL時對炎癥介質分泌的抑制作用最強。然后以小鼠的足爪水腫增加率評價抗炎活性，飼喂d-DWE的小鼠的足爪水腫發生率均低于30%，說明d-DWE具有體內抗炎活性。經MALDITOF-MS鑒定，源自藻紅蛋白的十肽(LRDGEIILRY)和脫鎂葉綠酸具有抗炎活性。當十肽(LRDGEIILRY)的濃度為200 μg/mL時，RAW 264.7細胞中IL-6和TNF-α的分泌明顯減少。這是藻膽蛋白源抗炎肽的首次報道。

3 藻膽蛋白源降壓肽

高血壓是引起心血管疾病的潛在危險因素，慢性腎功能衰竭、中風等疾病也是由持續性高血壓引起的。腎素-血管緊張素調節系統(RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(KKS)是人體血壓的重要調節系統。血管緊張素轉化酶(ACE)是這2個調節系統中的關鍵酶。ACE的抑制可以導致血管緊張素Ⅱ減少和血管擴張劑緩激肽增加，起到降血壓的作用。目前ACE是降壓藥物的主要作用靶點[28]。ACE抑制肽序列在C-末端通常含有較多的疏水性氨基酸殘基，N-末端含有支鏈脂肪族氨基酸殘基，譬如STSFPPK[29]、LAHMIVAGA和VAHPVF[30]等。伍強等[31]用胃蛋白酶和胰蛋白酶先后消化紅毛菜R-藻紅蛋白，酶解產物ACE半數抑制濃度(IC50)為191.1±4.1 μg/mL，經Sephadex G-15凝膠層析和反相-高效液相色譜純化得到2個ACE抑制肽：AILAGDPSVLEDR 和 VVGGTGPVDEWGIAGAR，IC50分別為57.2±5.0和66.2±4.2 μg/mL，兩種多肽都不能被胃腸道中常見的蛋白酶破壞，故能夠被胃腸道吸收而發揮其ACE抑制活性。Yumi Kitade等[32]在測定日本馬澤藻的三種藻膽蛋白一級結構時發現日本馬澤藻與其他紅藻有較高的同源性，含有其他紅藻中已鑒定的ACE抑制肽序列YRD、LDY、LRY、VY、LF和FY[33–35]。對日本馬澤藻參照Furuta的方法[33]使用熱裂解酶水解后，結合體外ACE抑制活性實驗，驗證了水解物具有較高的ACE抑制活性（約為63%），氨基酸序列分析顯示其富含疏水氨基酸殘基(46.0%～ 52.3%)，特別是芳香族（Y和F）或支鏈（V、L和I）側鏈殘基。

4 藻膽蛋白源降糖肽

糖尿病是由于胰島素分泌缺陷或其功能受損，或兩者兼有引起的一種以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病可能導致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害和功能障礙。目前糖尿病的治療主要是刺激胰腺分泌胰島素，減少肝臟輸出葡萄糖，幫助肌肉細胞、脂肪細胞和肝臟從血液中吸收更多的葡萄糖等。用于治療Ⅰ型糖尿病的藥物主要是胰島素。鑒于胰島素不能直接口服及口服降糖藥的毒副作用，尋找安全無毒副作用的藥物受到廣泛關注。具有降糖活性且無毒副作用的生物活性肽成為降糖藥物的一個重要來源。

藻膽蛋白源多肽在不同動物模型中具有體內降血糖活性[36]。Li等[37]用胰蛋白酶消化鈍頂螺旋藻藻膽蛋白，將酶解產物用二肽基肽酶-IV（DPP-Ⅳ酶）和Caco-2細胞模型進行體內外的降血糖活性表征，結果表明，PBP酶解產物在體外對DPP-Ⅳ酶活性有抑制作用，酶解產物濃度為2.5 mg/mL時，DPP-Ⅳ酶酶活降低了55.3%，且與劑量呈正相關，IC50值在0.5～ 1 mg/mL范圍內。酶解產物經HPLC-Chip-ESI-MS/MS鑒定得到26種多肽，其中各有13條分別來自于C-藻藍蛋白和別藻藍蛋白。Maria Cermeno[38]用堿性蛋白酶和復合風味蛋白酶對紫菜中的藻膽蛋白進行酶解，測定酶解產物及各組分的氧自由基吸收能力、血管緊張素轉換酶(ACE)和二肽基肽酶（DPP-Ⅳ酶）的抑制活性，利用半制備反相高效液相色譜和液相色譜-質譜聯用技術對水解物進行分離鑒定，得到三種肽：DYYKR、YLVA和TYIA，其中YLVA具有最高的DPP-IV抑制活性(IC50=439±44μmol/L)，DYYKR 具有最高的 ORAC 活性（4.27±0.15 μmol Trolox當量/μmol/L），TYIA具有最高的ACE抑制活性(IC50=89.7±7.10μmol/L)。這是首次在紫菜的藻膽蛋白中獲得具有降糖活性的藻膽蛋白肽。

5 藻膽蛋白源抗腫瘤肽

目前的抗腫瘤藥物普遍存在效率低、選擇性差、毒副作用大、易產生腫瘤細胞耐藥性等問題[39]。尋找高效、毒副作用小、選擇性強的抗腫瘤藥物是抗腫瘤治療的當務之急。食源性生物活性肽因是在胃腸道消化或食品加工過程中由蛋白降解而來，具有分子量小、易被人體吸收、毒副作用小、無免疫原性等優點，為癌癥的預防和治療提供了新思路，受到國內外研究人員的關注[40]。

藻膽蛋白已被證明能夠抑制肝癌[41]、乳腺癌[42]、卵巢癌[43]、結腸癌[44]、非小細胞肺癌[45]和惡性黑色素瘤[46]等。藻藍蛋白可通過細胞色素C誘導人慢性粒細胞白血病K562細胞調亡[47]。鑒于藻膽蛋白的抗腫瘤活性，尋找具有抗腫瘤活性的藻膽蛋白肽受到廣泛關注。范曉丹等[48]從壇紫菜蛋白的胰蛋白酶水解物中分離到3條對人乳腺癌細胞MCF-7、肝癌細胞HepG-2、胃癌細胞SGC-7901、肺癌細胞A549和結腸癌細胞HT-29具有抗增殖活性的活性肽：VPGTPKNLDSPR、MPAPSCALPRSVVPPR 和 VR，IC50為 191.61～ 316.95 μg/mL。其中VPGTPKNLDSPR和MPAPSCALPRSV VPPR對人肝癌細胞MCF-7和HepG-2有較好的抑制作用，IC50分別為200.97 μg/mL和276.85 μg/mL。VR在濃度為500 μg/mL時，對MCF-7和HepG-2細胞的抑制率分別為66.3%和64.1%。人工合成的VPGTPKNLDSPR能使MCF-7的細胞周期阻滯在G0/G1期，并誘導細胞凋亡。Mao[49]也在壇紫菜蛋白的木瓜蛋白酶水解物中分離鑒定出一種新的多肽QTDDNHSNVLWAGFSR，對HepG-2細胞的抑制率達61.36%，IC50為271.6 μg/mL。

6 藻膽蛋白源抗菌肽

抗生素的濫用使微生物產生抗藥性，從而影響抗生素對人類和動物細菌感染的療效。傳統的抗生素是通過抑制細菌細胞壁或DNA的合成而發揮作用，而抗菌肽主要通過在細胞膜上打孔殺滅細菌。利用抗菌肽治療細菌感染不會導致耐藥菌株的產生，故有望開發成為新型多肽類抗生素。

藻膽蛋白具有廣譜的抗菌活性[50–52]。螺旋藻藻藍蛋白對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌和嗜水氣單胞菌等都具有抑制作用[52]。孫宜君等[53]利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解螺旋藻蛋白，酶解產物分別通過Sephadex G-25凝膠層析、RP-HPLC和Superdex 75 10/300層析柱純化，用MALDI-TOF/TOF-MS和LTQ串聯質譜鑒定出抗菌多肽KLVDASHIRLATGDVAV RA，對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為8 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC值）為16 mg/mL，在較高濃度時（8×MIC值）仍無溶血活性。進一步研究發現，該抗菌肽能夠增加大腸桿菌細胞膜的通透性并使細胞內部鉀離子泄漏，破壞細胞膜的完整性，當抗菌肽穿透已發生損傷的細胞膜屏障后，其與DNA和RNA結合，首先抑制RNA合成，進而抑制細菌DNA合成和復制，使大腸桿菌G1期細胞數目顯著增加，通過多種因素導致細菌死亡。付云等[54]采用枯草芽孢桿菌發酵螺旋藻渣，發酵產物具有顯著的抗金黃色葡萄球菌效果，對發酵產物使用Sephadex LH-20凝膠層析和RP-HPLC分離純化，MALDI-TOF-MS鑒定得到抗菌多肽ATHDNCCLRQS，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.014 mg/mL，該抗菌肽可使金黃色葡萄球菌細胞內鉀離子泄露導致細胞膜通透性增加，同時抑制菌體蛋白合成和競爭性結合DNA，從而抑制細菌生長繁殖，其抑菌效果比枯草芽孢桿菌自身代謝產物伊枯草菌素[55]和KLVDASHIRLATGDVAVRA更強。

7 藻膽蛋白源免疫調節肽

生物活性肽的免疫調節功能包括免疫增強、抗炎作用等。有的抑制LPS誘導的與B細胞活性相關的NFκB的核易位，抑制IL-1β和增強TNF-α的釋放[56]。有的抑制T淋巴細胞的表面CD69的表達和IL-2的分泌，抑制T淋巴細胞中TNF-α和IFN-γ的分泌[57]。有的明顯提高IL-2、IL-4和IL-6的產生[58]。

藻藍蛋白可顯著增加正常小鼠和免疫功能低下小鼠脾細胞中抗體形成細胞的數量和產生抗體的能力，以增強免疫細胞活性從而提高機體的免疫力[59,60]。楊磊[61]利用木瓜蛋白酶消化螺旋藻泥制備得到酶解多肽，在免疫功能低下小鼠模型上實驗，選取免疫臟器重量測定、碳粒廓清實驗、抗體生成細胞含量、血清溶血素含量作為檢測指標，并以螺旋藻粉作對照，結果發現酶解產物不僅能顯著提高正常小鼠的免疫功能，而且能顯著提高免疫低下小鼠的臟器指數、廓清指數和吞噬指數、抗體生成細胞含量及血清溶血素含量(P<0.01)；而灌胃螺旋藻粉小鼠的各指標與正常或免疫低下小鼠的均無顯著差異(P>0.05)。

表1 藻膽蛋白源生物活性肽的結構和功能匯總表

8 展望

藻膽蛋白是廣泛存在于藻類細胞中的一大類安全、健康的食物蛋白，具有獨特的分子結構和生物學活性，在醫藥和健康領域具有廣闊的應用前景。目前已經從螺旋藻、紅皮藻、紅藻、紫菜和裙帶菜等藻類的藻膽蛋白中獲得多種生物活性肽。但藻膽蛋白源生物活性肽的研發也遭遇一些困難：（1）藻膽蛋白源活性肽的制備多依賴于傳統的酶解法，存在一定的盲目性；（2）用于酶解的蛋白酶不能循環利用，既增加了研發成本，又可能影響后續的分離純化。筆者提出，可以嘗試利用酶固定化技術將蛋白酶固定，可以對藻膽蛋白連續水解，這樣能夠在一定程度上控制水解度和減少酶的浪費。隨著生物信息學的發展以及對活性肽的構-效關系的深入研究，利用計算機輔助模擬蛋白消化過程，將蛋白質模擬酶切得到的氨基酸序列輸入生物活性肽數據庫進行比對，可以預測生物活性肽。頡宇等[62]基于BIOPEP數據庫，借助計算機輔助和酶解法相結合，定向制備出檸條籽蛋白抗氧化肽，這為生物活性肽的發掘和鑒定提供了新策略。隨著現代分離、鑒定技術與生物信息學的發展，生物信息學預測與實驗相結合的研究方法勢必推動藻膽蛋白源活性肽的研發和應用。相信在不久的將來，越來越多的新型藻膽蛋白源活性肽將會被不斷發掘、鑒定。