兩種野生大豆不同生育期光合特性及染色體核型比較

田 鑫，鐘 程，羅 歡，李雪飄

（凱里學院大健康學院，貴州凱里556011)

0 引言

野生大豆(Glycine soja Sieb.&Zucc.)是栽培大豆的近緣野生物種，屬于蝶形花科大豆屬一年生草本植物。野生大豆莖葉可作飼料，種子可食用，全株可入藥，是非常重要的野生資源，在農牧業育種方面也凸顯重要作用[1]。野生大豆因其資源多、分布廣、蛋白含量高、品質特異[2]，具有抗逆境脅迫的適應能力強、遺傳多樣性豐富，蘊藏著多種適應各種生態環境的獨特基因資源[3]。野生大豆對于豐富栽培大豆基因型、種質資源創新及遺傳改良方面具有重要作用[4]。但因其粒小、蔓生、易裂莢等的特性一直未能充分開發利用，葉綠體是葉片光合作用中心，對干物質的積累有重要影響，因此，光合參數直接影響作物產量[5]，生產上光合作用是影響大豆產量和品質的關鍵因素，光和能力強弱直接關系到產量和品質的積累[6]，通過篩選高光合野生大豆材料是提高大豆光合效率的有效途徑。對于同一作物不同品種間或同一品種個體間的光和能力存在差異，Sakoda[7]研究了不同基因型大豆的光合能力，找出了其中光合能力強的品系14。關于大豆光合特性研究大多集中在栽培品種，遺傳基礎狹窄。近年來通過野生大豆改良大豆品種，已篩選出優質、抗性強的材料[8]。但是，關于野生大豆在光合特性方面的研究較少。主要研究關于野生大豆與栽培品種的雜交后代的光合變化[5,9]或野生大豆在逆境脅迫下對光合作用產生的影響[10]，除對野生大豆進行光合特性研究之外，在染色體核型上也有一定研究。Ahmad等[11]用數量統計方法分析得到野生大豆核型為2n=24m+14sm+2st。Ladizinsky等[12]發現大豆染色體C帶擁有4種不同帶型。鄭惠玉等[13]發現野生大豆染色體有4個隨體現象。鐘珍萍等[14]等發現3種野生大豆都含有1對最長染色體隨體。因此，野生大豆染色體帶型種類繁多，結合黔東南州野生大豆資源，開展該地區野生大豆染色體核型研究對深入系統開發和選育新種質提供可靠的理論依據。本研究以前期收集到的兩份野生大豆為材料，通過光合指標的測定，比較不同類型的野生大豆的光合能力強弱，以期獲得較高光合能效的野生大豆材料，為后續的大豆遺傳改良提供方法和材料基礎。同時對根尖染色體核型進行比較，對挖掘作物的親緣關系和指導后續雜交育種具有重要意義，為物種進化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料于2017年12月在丁扒山和凱里學院收集獲得（由黔東南州林業局高級農藝師王定江鑒定），于2018年3月12日播種于凱里學院實驗地，整個生長期進行常規管理。兩種野生大豆外觀形態差異表現為：丁扒山野生大豆（丁豆）的葉片橢圓、花期為10月上旬至11月上旬、花色為淡紫色、豆莢邊緣褐色絨毛、豆莢光滑；凱里學院野生大豆（凱豆）葉片為披針形、花期為8月中旬至9月下旬、花小且花色為紫色、豆莢附有褐色絨毛。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量測定方法 使用SPAD-502 Plus測定葉綠素含量，測定方法同光合特性測定。

1.2.2 各生育期光合特性測定 根據Fehr等[15]提出的大豆生育期鑒定方法，研究其營養期25節期(V25)、盛花期(R3)、結莢期(R5)3個時期，每個時期于晴天上午8:00—18:00選擇生長健壯、長勢一致且無病蟲害植株各3株，在各株的同一部位和同一方向選取3片葉進行測定，重復3次取平均值。每隔2 h測定一次，待數值穩定后記錄其凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、光強(Par)。

1.2.3 光響應曲線的測定方法 光響應曲線測定采用LI-6400XT紅藍光源。測定時間為9:00—14:00，光合有效輻射梯度為2000、1600、1200、800、400、200、100、50、20、0 μmol/(m2·s)。每次測定前矯正 15～ 20 min。CO2濃度為 500 μmol/(m2·s)，記錄 Pn、Ci、Gs、Tr等指標。用葉子飄等[116]提出的修正模型對曲線進行擬合。

1.2.4 根尖染色體處理 于8:00—9:00選取長勢良好粗壯無病蟲害的根尖，采用AEG法進行處理[17-18]。選取乳白色根尖1 mm左右進行展開壓平，用Giemsa染液染色10～ 15 min，烤片1～ 2 min，在OLYMPUS-BX53熒光顯微鏡觀察拍照。核型類型劃分及核型不對稱系數計算分別參照李懋學[17]和Arano[18]的方法。

1.2.5 數據分析及圖片制作 采用SPSS 23軟件進行數據分析，用DPS進行光合擬合，Photoshop完成作圖。

2 結果與分析

2.1 不同時期葉綠素含量的變化

由圖1可知，兩種野生大豆在營養期(V25)的差異不顯著，在盛花期和結莢期凱豆的葉綠素含量顯著高于丁豆。且同種野生大豆的不同時期葉綠素含量也存在顯著差異。丁豆營養期與盛花期差異不顯著，結莢期顯著高于營養期，盛花期和結莢期差異不顯著；凱豆的營養期與盛花期、結莢期差異顯著，但盛花期和結莢期無顯著差異且顯著高于營養期。

圖1 兩種野生大豆葉綠素含量比較

2.2 光合速率日變化

由圖2可知，丁豆結莢期呈先上升后下降的趨勢，營養期和盛花期呈下降趨勢。凱豆營養期、盛花期、結莢期光合速率均呈先上升后下降的趨勢，凱豆3個時期光合速率在10:00時出現峰值，丁豆營養期光合速率在10:00時出現峰值。兩種野生大豆在同一時間的光合速率差異顯著。在早上8:00時，丁豆營養期與盛花期無顯著差異，營養期和盛花期與結莢期差異顯著，營養期>結莢期，凱豆結莢期、營養期、盛花期的光合速率間差異顯著，結莢期>盛花期>營養期，且凱豆光合速率顯著高于丁豆光合速率。當10:00時，凱豆光合速率顯著高于丁豆光合速率，凱豆營養期與結莢期差異顯著，且結莢期>營養期，營養期與盛花期差異不顯著，盛花期與結莢期差異不顯著。丁豆3個時期間差異不顯著。當12:00時，凱豆的3個時期光合速率顯著高于丁豆的光合速率，丁豆的盛花期顯著高于營養期和結莢期。當14:00時，凱豆3個時期差異顯著，丁豆盛花期高于營養期和結莢期。在16:00時，凱豆和丁豆的盛花期與結莢期差異不顯著，但兩者與營養期差異顯著。在18:00時，丁豆的盛花期與結莢期差異不顯著，兩個時期與營養期差異顯著。凱豆的3個時期間均存在顯著差異，且盛花期>結莢期>營養期。

圖2 兩種野生大豆光合速率比較

2.3 氣孔導度日變化

由圖3可知，凱豆結莢期氣孔導度呈下降趨勢，營養期和盛花期呈單峰曲線，在10:00時出現峰值。丁豆的營養期氣孔導度呈下降趨勢，盛花期和結莢期呈單峰曲線，在10:00時盛花期出現峰值，在12:00時結莢期出現峰值。在8:00—18:00時，凱豆結莢期顯著高于盛花期和營養期，氣孔導度大小為結莢期>盛花期>營養期。在8:00時，凱豆結莢期顯著高于營養期和盛花期，同時也顯著高于丁豆3個時期，丁豆營養期顯著高于盛花期和結莢期。在10:00時，凱豆3個時期存在顯著差異，結莢期>盛花期>營養期，丁豆3個時期差異不顯著，凱豆3個時期均顯著高于丁豆。在12:00—14:00時，凱豆3個時期差異顯著，結莢期>盛花期>營養期，丁豆結莢期顯著高于營養期和盛花期，營養期和盛花期差異不顯著，其中，凱豆盛花期和結莢期顯著高于丁豆結莢期和盛花期。在18:00時，凱豆結莢期顯著高于營養期和盛花期。

圖3 兩種野生大豆氣孔導度比較

2.4 胞間CO2濃度日變化

由圖4可知，凱豆結莢期的胞間CO2濃度呈下降趨勢，營養期和盛花期的胞間CO2濃度呈先下降后上升的趨勢。丁豆營養期呈先下降后上升再下降的趨勢，其盛花期呈下降趨勢，結莢期呈雙峰曲線。同時，在8:00時，凱豆3個時期均大于丁豆3個時期，兩種野生大豆胞間CO2濃度均為營養期>盛花期>結莢期。在10:00時，凱豆盛花期和結莢期均大于丁豆盛花期和結莢期；凱豆胞間CO2濃度差異顯著，結莢期>盛花期>營養期；丁豆營養期和結莢期差異不顯著，營養期和結莢期顯著高于盛花期。在12:00時，凱豆盛花期和結莢期均大于丁豆盛花期和結莢期，其結莢期顯著高于營養期和盛花期，丁豆胞間CO2濃度為營養期>結莢期>盛花期。在14:00時，凱豆3個時期的胞間CO2濃度均大于丁豆3個時期，其大小為營養期>結莢期>盛花期，丁豆大小為營養期>盛花期>結莢期。在16:00時，丁豆大小為營養期>盛花期>結莢期，凱豆營養期和盛花期顯著高于結莢期。在18:00時，凱豆營養期顯著高于盛花期和結莢期，丁豆大小為營養期>結莢期>盛花期。

圖4 兩種野生大豆胞間CO2濃度比較

2.5 蒸騰速率日變化

由圖5可知，兩種野生大豆蒸騰速率均呈先上升后下降的趨勢，凱豆盛花期和結莢期在14:00時達到峰值，營養期在12:00時出現峰值。在12:00時丁豆營養期和盛花期蒸騰速率最高，在14:00時結莢期蒸騰速率最大。在8:00時，丁豆結莢期顯著高于凱豆，丁豆結莢期顯著高于營養期和盛花期，凱豆盛花期>結莢期>營養期。在10:00時，丁豆盛花期顯著低于凱豆，凱豆大小為結莢期>盛花期>營養期，丁豆結莢期顯著高于營養期和盛花期。在12:00時，凱豆盛花期顯著高于丁豆盛花期，其盛花期和結莢期顯著高于營養期，丁豆結莢期>盛花期>營養期。在14:00時，凱豆3個時期顯著高于丁豆3個時期，兩種野生大豆蒸騰速率均為結莢期>盛花期>營養期。在16:00時，兩種野生大豆蒸騰速率均為盛花期>結莢期>營養期。在18:00時，丁豆大小為盛花期>結莢期>營養期，凱豆結莢期顯著高于營養期和盛花期。

圖5 兩種野生大豆蒸騰速率比較

2.6 光響應曲線

從表1可知，丁豆營養期在0～ 1200 μmol/(m2·s)范圍內的光合速率呈上升趨勢，在1200～ 2000 μmol/(m2·s)呈下降趨勢；丁豆盛花期和結莢期在0～ 1600 μmol/(m2·s)范圍內的光合速率呈上升趨勢，在1600～ 2000μmol/(m2·s)范圍內呈下降趨勢。在0～ 100 μmol/(m2·s)范圍內的光合速率為營養期>結莢期>盛花期。凱豆的光合速率隨著光照強度的變化而變化，光照強度越強，光合速率越大，但隨著光照強度的增大，光合速率受到抑制，開始呈下降趨勢。光照強度在 2000 μmol/(m2·s)，營養期、盛花期、結莢期的光合速率均小于1600 μmol/(m2·s)時的光合速率。

表1 兩種野生大豆光響應曲線比較

由圖6a可知，丁豆光合速率為盛花期>結莢期>營養期，在光照強度為 1600 μmol/(m2·s)均有光抑制現象。由圖6b可知，凱豆光合速率大小盛花期>結莢期>營養期。營養期、盛花期、結莢期的光合速率均呈上升趨勢，但在光照強度為2000 μmol/(m2·s)時，3個時期的光合速率均小于光照強度為1600 μmol/(m2·s)的光合速率。

將兩種野生大豆的營養期、盛花期、結莢期3個時期進行DPS數據擬合，并計算其光補償點(LCP)、光飽和點(LSP)、最大凈光合速率(Pmax)。通過DPS 7.05擬合得出相應的擬合值及參數，將對應的擬合值作圖及擬合出的參數分別帶入式(2)、(3)、(4)計算出LCP、LSP、Pmax結果如表2所示。

表2 營養期、盛花期及結莢期的LCP、LSP、Pmax、Rd

結合圖6和表3可知，當光照強度大于光飽和點時的光照強度時，野生大豆受到光抑制現象；當光照強度小于光補償點時，野生大豆無法正常光合作用，只能進行暗呼吸。凱豆LCP、LSP、Pmax均為盛花期>結莢期>營養期。丁豆Rd為結莢期>營養期>盛花期，凱豆Rd為結莢期>盛花期>營養期；丁豆LCP為結莢期>盛花期>營養期，LSP和Pmax為盛花期>結莢期>營養期。

圖6 丁豆(a)及凱豆(b)光響應擬合修正的直角雙曲線模型

通過對野生大豆染色體中期分裂細胞的仔細篩選，挑選出染色體分散情況良好、染色體的數目完整、形態清晰的高質量染色體照片，且對所得到的染色體進行測量及分析，從而得到染色體的相關參數表（表3），根據染色體參數（染色體數、臂比值、不對稱系數）可得出野生種的類型。其相關參數內容包括染色體數，染色體臂比，類型，及染色體形態圖（圖7）。兙俥

根據染色體不同形態圖（圖7）及染色體核型參數表3可得出，野生大豆的染色體數目都為2n=2x=40，從染色體數目、臂比、不對稱系數、最長染色體/最短染色體進行分析得出2個野生種的核型公式2n=22m+16sm+2st，2n=24m+12sm+4st，丁豆和凱豆的核型參數存在差異，其不對稱系數分別為61.93%、64.31%，兩種野生大豆共有24條染色體為中部著絲粒染色體，14條為近中部著絲粒染色體，2條為端部著絲粒染色體。環境差異越大，不對稱系數差異越大，兩種野生大豆的不對稱系數差異不大，因此，兩種大豆的生境條件相近。

表3 野生大豆核型比較

圖7 兩種野生大豆染色體形態圖

3 討論與結論

野生大豆光合速率日變化呈雙峰曲線，存在“光合午休”現象，是野生大豆自身對正午強光和高溫等環境因素的適應力，氣孔導度和胞間CO2濃度影響植物光合作用和蒸騰作用，兩種野生大豆出現午休現象之后，光合速率均呈下降趨勢。引起光合午休現象的因素主要有生態因子、生理因子和生化因子[21]，生態因子是外部因素[22]（包括溫、光、水、氣、肥等的影響），植物本身是受氣孔和非氣孔因素影響，非氣孔因素受葉片自身因素、葉綠素含量、光合酶活性變化的影響[23]，這與吳廷娟[24]的研究結果一致，本研究主要受氣孔因素影響，由于野生大豆葉片出現反卷現象，胞間CO2濃度降低，導致光合速率降低。當光強超過光飽和點之后，發生光抑制現象，消耗掉自身制造的有機物。本研究得出，兩種野生大豆的光飽和點(LSP)為1067.6232～ 2000.0000 μmol/(m2·s)，光 補 償 點 (LCP)為 8.5143～ 18.1563 μmol/(m2·s)，兩種野生大豆的LSP較高，LCP較低，而陰生植物的LSP在50～ 1000 μmol/(m2·s)，LCP在 20 μmol/(m2·s)[25]，可見，這兩種野生大豆是耐陰植物，凱豆的LSP>丁豆，凱豆屬高光效植物，丁豆LCP為結莢期>盛花期>營養時期，LSP為盛花期>結莢期>營養時期；凱豆LCP、LSP均為盛花期>結莢期>營養時期。兩種野生大豆在盛花期的光合效能最高，有利于有機物積累，Pmax在 7.8613～ 19.2078 μmol/(m2·s)，凱豆的羧化效率較高，光合電子傳遞活性高，因此對CO2的同化效率高，與LSP的結果一致，光響應曲線擬合的結果均符合修正的直角雙曲線模型與索榮臻等[9]研究結果一致。

野生大豆的染色體數目均為2n=2x=40的二倍體這與壽惠霞等[26]結論一致。兩種野生大豆不對稱系數較大，染色體較不對稱這與鐘珍萍等[27]研究一致。丁豆核型為2B型，凱豆為2C這與王建波等[28]研究存在差異，可能是不同野生種，同時還受地理環境的影響。需在后續的實驗中進行基因鑒定，判斷是否與王建波的野生大豆是不同種才能確定產生差異的原因。

葉片光合能力的強弱與葉綠素含量有關[29-30]；植株的葉綠素含量越高，葉片光合能力越強，本研究發現凱豆的葉綠素含量較丁豆高，凱豆的光合速率、氣孔導度、胞間CO2、蒸騰速率均高于丁豆，因此光和能力較強，光能利用率高。