規模化奶牛場犢牛腹瀉的病原檢測與分析報告

阮繼湘，劉文曉，江 波，許 健，李永清，程 晶＊

1 中牧實業股份有限公司，北京 100070

2 北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097

0 引言

隨著我國養牛業的持續發展，犢牛腹瀉病的發生呈上升趨勢。引起該病的原因很多，主要分為感染性和非感染性。若沒有及時找到病因進行有效治療，則會影響新生犢牛的生長和繁育，嚴重者甚至出現死亡，造成經濟損失。因此，對患病犢牛做出及時準確的診斷和治療，可以保證牛只健康，促進養牛業持續健康發展。

2021年入夏以來，收到內蒙古某規模化奶牛場牛群出現犢牛腹瀉病況的報告。患病牛涉及1～6 月齡犢牛，牧場256頭犢牛中，20 頭出現腹瀉癥狀。主要癥狀是持續腹瀉20 多天，糞便呈黃綠色水樣，部分犢牛糞便中帶有血液和黏液。大部分出現脫水和衰弱；體溫38.8～39.3 ℃；聽診心跳快，肺部濕羅音，瘤胃處有鋼管音。曾以頭孢嘧啶和恩諾沙星治療，但效果不佳，并出現了3 頭牛死亡，約占發病牛的15.00%。為查明腹瀉發生和流行的原因，對腹瀉犢牛的血液和糞便進行細菌、病毒和寄生蟲的病原學和核酸檢測，對腹瀉犢牛血清進行病毒抗體檢測。

1 材料與方法

1.1 病料

對腹瀉犢牛進行現場采樣，采集腹瀉犢牛血液及血清樣品各20 份。直腸糞便采樣，收集水樣糞樣6個，稀便糞樣3 個，共計9 個糞樣。

1.2 血清抗體檢測

用牛副結核、牛病毒性腹瀉/黏膜病酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）檢測試劑盒（IDEXX公司）分別檢測牛副結核分枝桿菌抗體以及牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗體，具體操作步驟按試劑盒說明書進行；同時以病毒中和試驗檢測牛輪狀病毒和冠狀病毒抗體。

1.3 細菌分離鑒定

選擇腹瀉癥狀嚴重的病牛直腸糞便，以Cary-Blair氏運送培養基（一種專門用于空腸彎曲桿菌、霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌等腸道致病菌標本的采集、運輸和短期保存的培養基）保存運輸。取少量樣品直接劃線接種于麥康凱平板用于大腸桿菌的分離；進而利用沙門氏菌專用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液進行37.0 ℃過夜培養，增菌液劃線接種于沙門氏菌顯色鑒別培養瓊脂平板，用于沙門氏菌的分離培養；最后利用Bolton肉湯于微需氧產氣袋的厭氧罐中37.0 ℃過夜培養，將增菌液劃線接種于彎曲桿菌選擇培養基（CCDA平板），于37.0 ℃厭氧罐中培養48 h。挑取生長一致的單個菌落涂片鏡檢并進行生化試驗鑒定及聚合酶鏈式反應（PCR）鑒定。

彎曲菌三重PCR鑒定：取疑似彎曲菌培養菌液0.5 mL，離心后去除上清液，菌沉淀加入50.0 μL純水重懸，煮沸5 min，離心后取上清液用于三重PCR檢測。三重PCR檢測方法參考文獻[2]進行，即同時擴增彎曲菌屬16S rRNA基因（857 bp）、空腸彎曲菌mapA基因（589 bp）和結腸彎曲菌ceuE基因（462 bp）。

1.4 寄生蟲卵檢測

取腹瀉犢牛糞便約10.0 g，加飽和食鹽水100.0 mL混勻，通過60 目銅網過濾于小燒杯中，立即吸取濾液至小青瓶中形成凸面，靜置30 min后，以清潔載玻片輕觸液面于顯微鏡下檢查蟲卵[3]。

1.5 病毒檢測

分別取磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的糞便上清以及血液樣品200.0 μL，使用病毒/細菌核酸柱式提取試劑盒提取樣品核酸（北京森康生物技術有限公司）。使用牛病毒性腹瀉熒光RT-PCR檢測試劑盒（北京森康生物技術有限公司）檢測牛病毒性腹瀉病毒。將提取的樣品核酸反轉錄后進行輪狀病毒VP6基因以及牛冠狀病毒N基因PCR擴增，檢測引物[生物工程（上海）股份有限公司合成]見表1[2]。25.0 μL PCR反應體系如下：2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，擴增樣本cDNA/DNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR擴增條件為：94.0 ℃，2 min；94.0 ℃，30 s；55.0 ℃，30 s；68.0 ℃，40 s；68.0 ℃，5 min，40 個循環。取擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠核酸電泳后，用凝膠成像系統進行檢測。

表1 檢測牛冠狀病毒及輪狀病毒的引物序列

2 結果

2.1 血清抗體檢測

對所采集的20 份腹瀉犢牛血清進行腹瀉相關病原的ELISA檢測。結果表明，所有樣品的牛副結核桿菌抗體均為陰性，牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒抗體陽性率為65.00%；病毒中和試驗結果顯示，牛輪狀病毒抗體陽性率25.00%，而牛冠狀病毒抗體15.00%。

2.2 致病性細菌分離鑒定

對收集的9 份牛直腸糞便，進行不同菌落的形態觀察、生化試驗以及16sRNA PCR鑒定。PCR結果未發現產腸毒素型大腸桿菌和腸炎沙門氏菌等與下痢相關的致病菌株，但41號及57號牛直腸糞便樣品在彎曲菌選擇培養基CCDA上生長菌落，經彎曲菌三重PCR鑒定，其中1 株為結腸彎曲桿菌，另1 株為空腸彎曲桿菌（圖1）。

圖1 牛彎曲菌三重PCR 鑒定結果

2.3 寄生蟲卵檢測

對收集的9 份牛直腸糞便進行鏡檢，7 份糞樣中發現球蟲卵囊，球蟲卵囊檢出率達77.78%。同時，含有球蟲卵囊的糞樣中，有1 份糞樣發現蛔蟲卵，2份糞樣發現其他線蟲卵。

2.4 病毒檢測

針對牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、輪狀病毒以及冠狀病毒的結構蛋白編碼基因的檢測結果表明，在20份牛血液和9 份糞便樣品中，57號牛血液及糞便樣品為牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒核酸檢測陽性，糞便樣品中牛冠狀病毒核酸檢測陽性；此外，9號牛的糞便中檢測到牛冠狀病毒；28號牛的糞便樣品同時檢測到輪狀病毒和牛冠狀病毒；41號牛的血液樣品中檢測到牛冠狀病毒，糞便樣品中含有牛輪狀病毒；55號牛的糞便樣品中則含有牛冠狀病毒（圖2）。

圖1 牛彎曲菌三重PCR 鑒定結果

3 分析與討論

犢牛腹瀉是規模化奶牛場常見的一種消化系統疾病，一年四季均可發生。主要表現為急性或慢性下痢，不僅使奶牛的抵抗力變差，生長緩慢甚至引起死亡。調查資料表明，規模化奶牛場的犢牛腹瀉在斷奶前后的患病率和發病率通常分別為3.0%和0.5%，而本次牛場暴發的犢牛腹瀉率為7.81%，遠高于目前的平均發病率。

該病在不同時期存在不同的病因，一般可以分為營養性腹瀉和傳染性腹瀉。營養性腹瀉是由于營養因素和飼養管理不當而造成的消化不良，可以通過改變喂飼方式而改善；但傳染性腹瀉的致病因素比較復雜，包括牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、冠狀病毒、輪狀病毒等病毒，也可能因腸炎沙門氏菌、產毒型大腸桿菌、空腸彎曲桿菌和結腸彎曲菌引起。從實驗室收集的病料檢測結果來看，未發現腸炎沙門氏菌以及產毒型大腸桿菌，可能與病牛接受了抗菌藥物治療有關。但牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒，空腸彎曲桿菌、結腸彎曲菌，牛球蟲等病原感染嚴重，尤其是與腹瀉相關的病毒，如牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀腹瀉病毒等，不僅存在于腹瀉犢牛的糞便中，甚至引發了病毒血癥，因此，多病原同時感染或繼發感染是規模化奶牛場流行性犢牛腹瀉的主要因素。

這些病原體的感染和致病與氣候潮濕、多雨造成牛場污穢的環境密切相關。夏季正是奶牛腹瀉的高發和流行時期，奶牛場需要對該病高度重視。一是確保牛舍干凈的環境衛生和通風條件，并采取嚴格消毒等綜合防控措施；二是定期對全群牛進行血清學檢查，及時掌握病毒在牛群中的流行狀況，發現陽性牛，要堅決隔離、淘汰，以防疫情擴大；三是要做好牛只的定期驅蟲工作，以免球蟲等寄生蟲感染破壞牛腸上皮細胞造成繼發感染。

治療腹瀉，補液是關鍵。腹瀉發生時即灌服畜禽專用營養補液鹽，能有效緩解腹瀉牛出現脫水、電解質失衡和酸中毒等，同時應該根據藥敏試驗結果，使用敏感抗生素進行治療。針對此次疫情中分離的牛彎曲菌進行了藥敏試驗，篩選到具有高度抑菌作用的馬坡沙星等喹諾酮藥物，治療效果明顯。目前，我國已有牛病毒性腹瀉/黏膜病滅活疫苗上市，建議對感染嚴重的牛群實施預防接種。