低分子肝素對子宮內膜容受性的作用及其機制研究

牛凱迪，王春雪，于月新

（中國醫科大學北部戰區總醫院 生殖醫學中心，遼寧 沈陽110016）

良好的子宮內膜容受性有利于胚胎植入，而Wnt 通路在子宮內膜容受性中起關鍵作用[1]。Wnt/β-catenin 為經典的Wnt 信號通路，異常的β 連環蛋白表達將損害胚胎黏附和子宮內膜蛻膜化[2]。蛻膜化主要由孕激素引起，是子宮內膜基質細胞向蛻膜細胞轉化和子宮內膜血管床改變的過程。當這些變化不足時，胚泡無法嵌入，導致早期妊娠失敗[3]。妊娠期間，蛻膜細胞產生對胚胎發育至關重要的激素和細胞因子，分泌控制滋養層浸潤的因子[2]。有學者發現低分子肝素（LMWH）促進絨毛外滋養層細胞的分化和侵襲[4]。LMWH 調控白細胞介素-1β（IL-1β）誘導的胚胎干細胞中白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-11（IL-11）、白血病抑制因子的產生[5]，調節趨化因子[6]并增加胰島素樣生長因子和泌乳素[7]，其對細胞因子的調節超出抗凝作用。臨床LMWH 常經驗性用藥，但其對子宮內膜容受性影響的相關機制尚不清楚。本研究擬通過米非司酮復制胚泡植入障礙模型，進一步探究LMWH 對小鼠子宮內膜容受性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：TrizolTMReagent（美國Invitrogen 公司），逆轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒（上海近岸蛋白科技有限公司）。 儀器： 熒光定量PCR 儀（ABI7500，美國Applied Biosystems 公司），熒光倒置顯微鏡（DM4000B，德國Leica 公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物和分組48 只C57BL/6 雌鼠和16只C57BL/6 雄鼠[實驗動物生產許可證：SCXK（遼）2015-0001，實驗動物使用許可證：SYXK （軍）2012-0003]喂養于平均濕度（55±10）%、平均溫度（22±2）℃和明暗（12 h/12 h）控制的房間內，可自由進食和飲水。適應性飼喂1 周后，隨機將雌鼠分為對照組、造模組、LMWH 低劑量造模組和LMWH 高劑量造模組。本實驗獲得中國醫科大學北部戰區總醫院倫理委員會的批準（No：2019004）。

1.2.2 模型復制將25 mg 米非司酮片劑溶于31 ml丙二醇中配成0.8g/L 米非司酮溶液。于妊娠第4 天上午9∶00 皮下注射米非司酮溶液0.1 ml。

1.2.3 處理方法每日行脫落細胞學檢查，若為發情前期或發情期，于當晚5 點合籠，第2 天觀察到陰道栓或涂片發現精子，記為妊娠第1 天。自該日起，對照組、造模組每日皮下注射生理鹽水，LMWH 低劑量造模組、LMWH 高劑量造模組分別皮下注射100 IU/kg、150 IU/kg 的LMWH，持續至妊娠第4 天。妊娠第5 天上午行脊椎脫臼法處死小鼠。取出子宮內膜，統計胚胎數量。將子宮分成兩段，一段液氮速凍后，立即放入-80℃冰箱，另一段放入4%的多聚甲醛內避光待檢。

1.3 檢測指標

1.3.1 子宮內膜組織學檢測經垂直包埋，石蠟切片，蘇木素-伊紅染色法染色、脫水、透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察子宮內膜厚度和子宮內膜形態變化，并進行組間比較。

1.3.2 qRT-PCR將子宮組織剪碎，按照試劑盒說明提取RNA。逆轉錄后進行qRT-PCR，擴增條件：95℃預變性1 min，95℃變性20 s，60℃退火1 min，共40 個循環。每孔加樣3 份，重復3 次。檢測每組血小板內皮細胞黏附因子1（PECAM1）、同源框基因A10 （HOXA10）、Wnt7A 和β-catenin 的mRNA 水平。相對表達量以2-△△Ct表示。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，比較用方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LMWH對小鼠胚胎著床數量的影響

造模組子宮比對照組瘦、短，LMWH 低劑量造模組和LMWH 高劑量造模組子宮明顯較肥厚（見圖1）。各組胚胎數量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），LMWH 低劑量造模組和LMWH 高劑量造模組較造模組增加（P<0.05），LMWH 高劑量造模組最高；LMWH 高劑量造模組較對照組增加（P<0.05）。見表2 和圖2。

圖1 子宮圖

圖2 各組胚胎數量比較 （±s）

2.2 子宮內膜HE染色

造模組子宮內膜厚度薄，間質致密；LMWH低劑量造模組和LMWH 高劑量造模組子宮內膜增厚，子宮腺彎曲，腺腔擴大，螺旋動脈更長、更彎曲，間質呈生理性水腫，局部內膜疏松，LMWH高劑量造模組尤為明顯。各組腺體數量、血管數量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），LMWH 低劑量造模組和LMWH 高劑量造模組較造模組增加（P<0.05），而LMWH 造模組與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2和圖3。

表2 每組胚胎、腺體及血管數量比較 （n=12，±s）

表2 每組胚胎、腺體及血管數量比較 （n=12，±s）

注：①與造模組比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

組別對照組造模組LMWH低劑量造模組LMWH高劑量造模組F 值P 值胚胎數量8.08±0.79 6.00±0.74 8.50±0.67①9.17±0.58①②45.685 0.000腺體數量18.93±3.75 13.33±4.38 17.39±3.86①20.83±2.82①8.692 0.000血管數量16.27±2.24 11.87±3.58 16.58±3.81①16.84±2.52①6.897 0.001

圖3 HE染色圖 （×200）

2.3 各組HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA相對表達量比較

各 組HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05），LMWH 低劑量造模組和LMWH高劑量造模組較造模組增加（P<0.05）。結果表明，LMWH 可以改善子宮內膜情況，提高胚胎植入，作用機制與Wnt 通路和PECAM1、HOXA10 相關；LMWH 高劑量療效更佳，能更好地提高子宮內膜容受性。見表3 和圖4。

表3 各組HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA相對表達量比較 （n=12，±s）

表3 各組HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA相對表達量比較 （n=12，±s）

組別對照組造模組LMWH低劑量造模組LMWH高劑量造模組F 值P 值HOXA10 1.01±0.42 0.28±0.13 1.62±0.89 2.08±0.68 10.150 0.000 PECAM1 1.00±0.29 0.33±0.16 1.62±0.84 2.01±0.72 9.652 0.000 Wnt7A 1.00±0.47 0.28±0.18 2.37±0.90 4.11±0.91 36.350 0.000 β-catenin 1.00±0.58 0.15±0.07 1.24±0.29 2.26±0.52 3.734 0.028

圖4 各組HOXA10、PECAM1、Wnt7A、β-catenin mRNA相對表達量比較 （±s）

3 討論

HOXA10 作為子宮內膜容受性標志物，在分泌中期達到峰值[8]，這一時間與植入窗口期相同，其含量增加提示子宮內膜容受性的提高。本研究發現經過LMWH 治療后的小鼠，HOXA10 含量與造模組相比顯著增加。提示LMWH 存在提高子宮內膜容受性的作用，且這一作用與用藥劑量相關。

Wnts 是小鼠子宮形態發生和胚泡植入的重要調節因子[9]，其失調會導致腺體形成、蛻膜化和生育能力的缺陷。本研究發現，經LMWH 低劑量治療后，胚胎植入數量高于造模組，HE 染色新生血管的數量也較多。從分子層面來說，與造模組相比，不同劑量LMWH 造模組Wnt7A mRNA 和βcatenin mRNA 含量都顯著增加，LMWH 高劑量造模組效果優于LMWH 低劑量造模組。以上結果表明，LMWH 可以明顯改善胚泡植入失敗子宮內膜容受性，進而有利于胚胎植入。并且LMWH 作用通路可能為Wnt 通路。

胚胎和母體子宮內膜之間復雜的相互作用是著床過程的第一步，類固醇激素在其中發揮作用。孕激素與Wnt 通路相關，可影響人子宮內膜上皮細胞中的Wnt7A[10-11]。孕酮可在去卵巢小鼠體內誘導子宮內膜血管生成[12]，血管生成和重塑過程為母胎界面提供充足的血液供應，這對成功著床至關重要[13]。

PECAM1 作為新生血管的標志物，負責囊胚植入過程中胎盤的血流[14]。本研究發現，不同劑量LMWH 造模組PECAM1 較造模組顯著增加，說明LMWH 可能通過增加血管生成促進胚胎植入。胎盤血管生成對于正常胎盤循環以及胎兒發育至關重要，滋養層浸潤不足將導致血管-胎盤功能不全[15]。體外細胞培養發現，LMWH 可以促進滋養細胞侵襲，與本研究結果一致[16]。本研究仍有一定不足，只證明了LMWH、PECAM1 與Wnt 有關，未明確LMWH 作用靶點是PECAM1。母胎界面分子機制極為復雜，Wnt 可能不是LMWH 唯一作用通路，這些都值得進一步研究。