同位素內(nèi)標(biāo)-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飲料中咖啡因的含量

◎ 康雪梅，陶 燕，郭倩倩，李 新，李夢(mèng)雨，賈松濤，趙雪峰，趙林萍

（河南中標(biāo)檢測(cè)服務(wù)有限公司，河南 鄭州 450001）

咖啡因是一種黃嘌呤生物堿化合物，是一種中樞神經(jīng)興奮劑，能夠暫時(shí)驅(qū)走睡意并恢復(fù)精力，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇。有咖啡因成分的咖啡、茶、軟飲料及能量飲料十分暢銷，因此，咖啡因也是世界上最普遍被使用的精神藥品。過(guò)多的飲用攝入大量的咖啡因，導(dǎo)致作息不規(guī)律引發(fā)精神紊亂；還會(huì)引起腸痙攣。長(zhǎng)期飲用會(huì)引發(fā)慢性胃炎，刺激腎功能，導(dǎo)致兒童多尿，流失大量鈣質(zhì)，影響骨骼發(fā)育。2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單初步整理參考，咖啡因?qū)儆?類致癌物，即“尚不能分類”的致癌物[1]。

目前，咖啡因檢測(cè)方法主要有碘量法、HPLC法、近紅外光譜分析法、毛細(xì)管電泳法等。近幾年對(duì)于液質(zhì)法的使用逐漸增多，但基本也是外標(biāo)法的建立使用[2-7]。外標(biāo)法對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的測(cè)定難于避免基質(zhì)效應(yīng)等部分的影響。因此本文旨在建立同位素內(nèi)標(biāo)-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飲料中咖啡因含量的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

碳酸飲料（可樂(lè)）、功能型飲料（紅牛）、綠茶、咖啡等。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

甲醇（色譜純，美國(guó)賽默飛）；乙腈（色譜純，美國(guó)賽默飛）；甲酸（色譜純，美國(guó)賽默飛）；咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)G138494，純度98.8%，美國(guó)DR）；咖啡因-D3同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)照品（批號(hào)449472，100 mg·L-1，o2si）；試驗(yàn)用水為去離子水。

TSQ vanquish超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技）；天平，感量為0.1 mg（美國(guó)奧豪斯）；水浴鍋；超聲波清洗器，0.45 μm微孔水相濾膜（津騰）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

（1）咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg·mL-1）。準(zhǔn)確稱取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，4 ℃冰箱保存。

（2）咖啡因標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（1 μg·mL-1）。準(zhǔn)確吸取0.1 mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中用水定容后，4 ℃冰箱保存。

（3）咖啡因-D3同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（1 μg·mL-1）。準(zhǔn)確吸取1 mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中用水定容后，4 ℃冰箱保存。

（4）咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。分別吸取咖啡因標(biāo)準(zhǔn)中間液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和2.00 mL于10 mL容量瓶中，向其中分別加入0.1 mL咖啡因-D3同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，用水定容，得到咖啡因濃度分別為5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)濃度為10 ng·mL-1，臨用時(shí)配制。

1.3.2 樣品的制備凈化過(guò)程

（1）可樂(lè)型飲料。①脫氣。樣品用超聲清洗器在40 ℃下超聲5 min。②凈化。稱取5 g（精確至0.001 g）樣品，加入咖啡因內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（1 μg·mL-1）100 μL，加水定容至100 mL，搖勻，加入0.5 g氧化鎂，振搖，靜置，取上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，備用。

（2）不含乳的咖啡及茶葉液體制品。稱取5 g（精確至0.001 g）樣品，加水定容至100 mL，搖勻，加入0.5 g氧化鎂，振搖，靜置，取上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，備用。

（3）含乳的咖啡及茶葉液體制品。稱取1 g（精確至0.001 g）樣品，加入三氯乙酸溶液（10 g·L-1）定容至100 mL，搖勻，靜置，沉降蛋白，取上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，備用。

若樣品溶液中咖啡因含量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍需再做稀釋，相應(yīng)內(nèi)標(biāo)加入量要增加，使內(nèi)標(biāo)上機(jī)濃度為10.0ng·mL-1。

1.3.3 儀器條件

（1）色 譜 條 件。色 譜 柱，waters ACQUITY UPLC BEH C18，粒徑1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相：0.1%甲醇+0.1%甲酸水；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量，2 μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子源溫度：350 ℃；離子化方式：ESI+源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以咖啡因和咖啡因-D3峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 試樣溶液的測(cè)定

將試樣溶液注入液相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以保留時(shí)間及離子峰度比雙重定性，以咖啡因和咖啡因-D3峰面積比值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

采用不經(jīng)液相，直接手動(dòng)和自動(dòng)注射的方式，在正、負(fù)模式下切換，選擇合適的電離模式，結(jié)果顯示咖啡因在正離子模式下?lián)碛休^好的響應(yīng)度。然后在正離子模式下對(duì)咖啡因及咖啡因-D3進(jìn)行Q1母離子及Q3子離子進(jìn)行優(yōu)化，選取1個(gè)母離子和2個(gè)最優(yōu)子離子，并分別得到碰撞能，確定定性離子對(duì)和定量離子對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表1?？Х纫蚣翱Х纫駾3的總離子流圖和提取離子色譜圖、棒狀圖見(jiàn)圖1、圖2和圖3。

圖1 飲料中咖啡因和咖啡因-D3經(jīng)LC/MSMS分析得到的總離子流圖

圖2 飲料中咖啡因和咖啡因-D3經(jīng)LC/MSMS分析得到的提取離子色譜圖

圖3 飲料中咖啡因和咖啡因-D3經(jīng)LC/MSMS分析得到的提取離子棒狀圖

表1 咖啡因和咖啡因-D3的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)條件表

2.2 線性范圍、檢出限與定量限研究

用試劑分別配制濃度為0.1 ng·mL-1、 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1L、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1、200.0 ng·mL-1、500.0 ng·mL-1、1 000.0 ng·mL-1、2 000.0 ng·mL-1的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述質(zhì)譜條件下測(cè)定，以濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.2～500.0 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，飲料中咖啡因有較高的線性擬合度，以SN＞3時(shí)標(biāo)線的濃度對(duì)應(yīng)樣品的濃度為檢出限，以SN＞10時(shí)標(biāo)線的濃度對(duì)應(yīng)樣品的濃度為定量限。本法咖啡因的檢出限為0.2 ng·mL-1（相當(dāng)于1 g樣品定容體積為100 mL時(shí)，檢出限為20 ng·mL-1）；定量限為0.5 ng·mL-1（相當(dāng)于1 g樣品定容體積為100 mL時(shí)，定量限為50 ng·mL-1）。

2.3 回收率、方法重復(fù)性研究

由于市售綠茶、紅牛、咖啡等飲料咖啡因含量不均，且濃度較高，添加低濃度的咖啡因研究其回收率重復(fù)性無(wú)法獲取準(zhǔn)確結(jié)果，因此本試驗(yàn)將咖啡因-D3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加到可樂(lè)、綠茶、紅牛、咖啡中，添加濃度水平為20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、200 ng·mL-1的質(zhì)控濃度溶液，平行試驗(yàn)10次，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，待測(cè)物的回收率均大于84.3%，精密度均小于12.0%。

表2 方法的精密度和加標(biāo)回收率表（n=10）

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法對(duì)市售的紅茶、綠茶、咖啡、可樂(lè)、茶飲料等20個(gè)市售飲品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，咖啡因均有檢出，含量在50～2 000 μg·mL-1，這說(shuō)明市售的未標(biāo)明咖啡因含量的飲料也或多或少含有一定量的咖啡因，對(duì)于兒童等不易食用咖啡因的人群來(lái)說(shuō)是潛在的隱患。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)基于LC-MS/MS同位素內(nèi)標(biāo)法建立了市售飲料中咖啡因的快速定性定量分析方法。該方法簡(jiǎn)單易行，分析時(shí)間短，靈敏度高，重復(fù)型好，不僅能夠滿足日常實(shí)際檢測(cè)要求，對(duì)于痕量樣品的分析同樣適用。