枸杞枝條顆粒飼料對圍產期肉牛抗體水平、細胞因子及激素分泌的影響

王建東，安 魏，王亞軍，侯鵬霞，馬秀明，于 洋，梁小軍*

（1.寧夏農林科學院動物科學研究所，銀川 750002；2.寧夏農林科學院枸杞工程技術研究所，銀川 750002；3.銀川市西夏區三鑫綠源肉牛養殖專業合作社，銀川 750021）

枸杞屬于茄科灌木，具有很強的萌蘗能力，在生長期需要不斷的抹芽、剪枝；在休眠期需要對樹體進行整形修剪，形成豐產、穩產樹形。形成的枝條可作為飼料原料進行利用，不但解決資源浪費，同時在生態環境的保護上也起到關鍵作用。枸杞枝條的飼用化主要是利用其所含的枸杞多糖以及黃酮。據研究，不同生長期、不同區域的修剪枝條所含枸杞多糖為2.21 %～5.70 %，總黃酮為0.24 %～0.57 %。本試驗中枸杞枝條的添加是以“國家肉牛牦牛產業技術體系專項”課題組研發的飼料新產品“肉牛免疫增效功能性預混料”為參考，肉牛日糧添加枸杞多糖3g·d-1。本次測得枸杞枝條中枸杞多糖含量為4.5%，考慮到枝條中枸杞多糖利用效率等因素，選擇在日糧中添加枸杞枝條0.975 kg·頭-1·d-1[1]。本試驗通過對比不同試驗組圍產期肉牛的抗體水平、細胞因子及激素等指標的差異，以期進一步了解日糧中添加枸杞枝條對圍產期肉牛免疫指標的影響。

1 材 料

1.1 枸杞枝條顆粒飼料

枸杞枝條收集于寧夏枸杞產地，水分含量為10%～15%，采用刀片式粉碎機、錘式粉碎機進行兩段粉碎法粉碎成小段（≤5cm），壓成顆粒。測得其中多糖含量為4.5 %，水分含量為3.77 %，粗蛋白含量為18.4 %，粗灰分含量為10.0 %。

1.2 主要檢測試劑盒

免疫指標測定：肉牛免疫球蛋白A（IgA）ELISA試劑盒（生產批號E20200514-77090A）、免疫球蛋白G（IgG）ELISA試劑盒（生產批號E20200518-77091A）、免疫球蛋白M（IgM）ELISA試劑盒（生產批號E20200520-77092A）、γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒（生產批號E20200520-77020A）、白細胞介素-2（IL-2）ELISA試劑盒（生產批號E20200519-77028A）、白細胞介素-4（IL-4）ELISA試劑盒（生產批號E20200521-77029A）、白細胞介素-8（IL-8）ELISA試劑盒（生產批號E20200519-77031A）、白細胞介素-13（IL-13）ELISA試劑盒（生產批號E20200520-77360A），均由上海科淘生物科技中心生產；人腫瘤壞死因子（TNF-α）放射免疫分析藥盒（生產批號20200520），北京北方生物技術研究所生產。

激素指標測定：牛胰島素樣生長因子結合蛋白-2（IGFBP-2）ELISA試劑盒（生產批號GRE77235A）、牛胰島素樣生長因子結合蛋白4（IGFBP-4）（ELISA)試劑盒（生產批號GR-E77903A）、牛結合珠蛋白（HP）ELISA試劑盒（生產批號GRE77077A）、牛脫氧吡啶酚/脫氧吡啶啉（DPD）ELI?SA試劑盒（生產批號GR-E77128A）、牛骨堿性磷酸 酶（BALP）ELISA試劑盒（生產批號GRE77806A）、牛5羥色胺（5-HT）ELISA試劑盒（生產批號GR-E77625A）、牛酮體（KB）ELISA試劑盒（生產批號GR-E77812A），上海科淘生物科技中心生產；人胰島素（INS）放射免疫分析藥盒（生產批號20200520），北京北方生物技術研究所生產。

1.3 主要儀器

酶標儀（SM-3），北京天石天力公司產品；自動洗板機（ST360W），上海科華公司產品；電熱恒溫器（HH-W21-600），天津泰斯特有限公司產品；離心機（TDL80-2B），上海安亭科學儀器有限公司產品；γ-放射免疫計數儀（DFM-96），合肥眾成機電技術開發有限責任公司。

2 方 法

2.1 試驗設計

選擇體況相近、胎次相同、懷孕時間相同的圍產期肉牛60頭，分為2組，對照組飼喂基礎日糧，試驗組在基礎日糧的基礎上添加0.975 kg·頭-1·d-1的枸杞枝條顆粒飼料，其他營養管理均相同，飼喂42d，分娩后第42天進行采血，利用定量檢測卡檢測免疫球蛋白、細胞因子和激素水平。

2.2 血樣采集

試驗前、后各組牛尾靜脈采血0.5 mL，室溫放置1h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，然后于2000r·min-1離心10min，收集血清備用。

2.3 外周血液各種免疫因子和相關激素含量的檢測

采集試驗前后的血清，測定肉牛IgA、IgG、IgM、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-8、IL-13和IGFBP-2、IGFBP-4、HP、DPD、BALP、5-HT、KB含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作檢測；TNF-α和INS嚴格按照放射免疫分析藥盒說明書操作。

2.4 數據統計分析

利用SPSS20對所獲數據進行處理分析，同時采用χ2檢驗方法及t檢驗方法進行顯著性分析。

3 結果與分析

3.1 枸杞枝條顆粒飼料對圍產期肉牛免疫球蛋白、細胞因子水平的影響

測定圍產期母牛的免疫球蛋白水平、細胞因子水平，結果見表1。

表1 圍產期前后試驗母牛血液免疫球蛋白、細胞因子水平

由表1可見，添加枸杞枝條顆粒飼料的試驗組圍產期母牛IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4水平比對照組有所增加，其中IgA、IgG、IgM水平兩組間差異極顯著（P＜0.01），IL-4、IL-8、IL-13、TNF-α水平兩組間差異顯著（P＜0.05），IL-2、IFN-γ水平兩組間差異不顯著（P＞0.05），但均有所增加。

3.2 枸杞枝條顆粒飼料對圍產期肉牛激素、代謝產物水平的影響

測定的圍產期母牛激素水平，結果見表2。

表2 圍產期前后試驗母牛激素水平

由表2可知，添加枸杞枝條顆粒飼料的試驗組圍產期母牛INS、IGFBP-2、IGFBP-4、HP、DPD/BALP、5-HT比對照組有所升高，KB有所下降，但差異均不顯著（P＞0.05）。

4 討 論

4.1 枸杞枝條顆粒飼料對圍產期肉牛免疫于球蛋的影響

IgG、IgA、IgM是肉牛體內重要的免疫球蛋白，其含量的上升預示著體液免疫啟動。植物多糖可以誘導動物機體產生免疫球蛋白，繼而增強機體免疫功能。馬吉鋒等[2]研究表明，育肥架子牛日糧中添加枸杞多糖類飼料預混劑，飼喂14d時血液中免疫球蛋白含量極顯著的高于0d時，說明添加枸杞多糖可提高肉牛的體液免疫能力。本試驗圍產期母牛IgA、IgG、IgM含量有所增加，且與未飼喂枸杞枝條顆粒飼料母牛差異極顯著（P＜0.01），表明在圍產期母牛日糧中添加枸杞枝條顆粒飼料0.975 kg·頭-1·d-1，可以有效提高體液免疫水平。

4.2 枸杞枝條顆粒飼料對圍產期肉牛細胞因子的影響

IL-2的免疫治療已經應用多年，IL-2具有輔助T細胞分化的作用，并分泌細胞因子IFN-γ，IL-2除了輔助T細胞外，還可以促進靜息狀態的CD8+T細胞向記憶即效應T細胞的分化，說明IL-2有利于免疫記憶反應的形成[3]；IL-4的作用是促進Th2的分化，分泌細胞因子IL-4、IL-13。體外試驗發現，IL-4是一種具有多種生物學效應的細胞因子，如對于B細胞、T細胞、肥大細胞、巨噬細胞和造血細胞都有免疫作用，可以增強IgG、IgE水平[4]；IL-8具有趨化和激活中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞的作用，對于急、慢性炎癥、自身免疫性疾病等有重要作用；IL-13作為免疫調節細胞因子，可調節B細胞和單核細胞功能[5]；TNFα具有雙重生物學效應，較低濃度時主要作為白細胞和內皮細胞的自分泌及旁分泌的調節物，參與抵抗細菌、病毒和寄生蟲的感染，促進組織修復及調節炎癥反應，引起腫瘤細胞凋亡；IFN-γ具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節和抗寄生蟲的作用[6]。馬吉鋒等[2]研究表明，育肥架子牛日糧中添加枸杞多糖類飼料預混劑，飼喂肉牛免疫增效劑7d，即可促進肉牛細胞因子的分泌。本試驗圍產期母牛IL-2、IL-4、IL-8、IL-13、TNF-α、IFN-γ水平在試驗后有所增加，其中IL-4、IL-8、IL-13、TNF-α水平顯著增加（P＜0.05），表明在圍產期添加枸杞枝條顆粒飼料0.975 kg·頭-1·d-1，可以有效提高細胞免疫水平。

4.3 枸杞枝條顆粒飼料對圍產期肉牛激素水平的影響

激素和代謝物在大腦中起著飽腹信號的作用，在控制采食量中起著重要的作用。這些信號可以通過血流或腦脊液（CSF）到達下丘腦和腦干這兩個主要的纖維連接蛋白（FI）調節中心。近年來研究表明，胰島素樣生長因子（IGF）可能控制FI。IGF結合蛋白（IGFBP）是否在圍產期受到調節，并對限食作出反應，因此也可能影響FI。INS、IGF-2、IGF-4濃度是評價牛能量平衡狀況的三個指標[7]。通過INS、IGFBP-2或IGFBP-4的濃度可以評價哺乳初期的能量負平衡（NEB）；分娩前結合珠蛋白（HP）是產后母牛動員脂肪的預兆，本試驗圍產期母牛INS、IGFBP-2、IGFBP-4、HP試驗后有所升高，但差異不顯著P＞0.05，且處于正常范圍，表明在圍產期添加枸杞枝條顆粒飼料0.975 kg·頭·d-1，可以有效改善圍產期能量水平。

4.4 枸杞枝條顆粒飼料對圍產期肉牛相關代謝水平的影響

牛圍產期低血鈣癥用DPD/BALP值來評估。在哺乳期，5-HT與鈣離子代謝、葡萄糖穩態有關。產后第1天血漿中5-HT的濃度可以作為圍產期代謝紊亂及相關疾病的指示器，血清中5-HT與鈣離子濃度、甲狀旁腺激素相關蛋白水平正相關；血清中5-HT與產褥熱發病率負相關（r＜-0.33）。5-HT濃度增加將減少產褥熱的發病率。酮體KB監測可作為母牛酮病的診斷依據[8]。本試驗圍產期母牛DPD/BALP、5-HT、KB試驗后有所升高，差異不顯著（P＞0.05），且處于正常范圍，表明在圍產期添加該顆粒飼料0.975 kg·頭-1·d-1，可以降低相應的疾病癥狀發生。

5 結論

枸杞枝條含有一定量的枸杞多糖，枸杞多糖是其發揮功效的主要物質，飼喂枸杞枝條顆粒飼料0.975 kg·頭-1·d-1，飼喂42d后，可誘導機體產生免疫球蛋白、細胞因子等，提高圍產期肉牛機體免疫力。枸杞枝條作為一種新型、高效、綠色、多功能的飼料添加劑應用于肉牛生產中，有著良好的應用前景。