2018—2020年大連市規模奶牛場副結核抗體檢測分析

趙怡雯，蒼真偉，劉 佳，胡永倩，李 巍，楊 卓，程淑晶，張玉平，于漢勛

（1.大連市現代農業生產發展服務中心，遼寧 大連 116000；2.大連市畜牧總站，遼寧 大連 116000；3.大連市金弘基種畜有限公司，遼寧 大連 116000）

奶牛副結核病是由副結核分枝桿菌引起的慢性消化道疾病，世界動物衛生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。奶牛副結核病以頑固性腹瀉、漸進性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺褶[1-2]為特征。由于該病潛伏期長（1～2年）、病程長，細菌培養困難，在臨床上很容易被誤診為其他細菌類腹瀉疾病，使病牛得不到及時有效的醫治，并且牛副結核分枝桿菌屬于細胞內寄生菌，普通抗菌素不易進入細胞內，一旦出現臨床癥狀則很難醫治。由于病牛的反復腹瀉常導致體重下降和產奶量降低，對奶牛場（戶）造成嚴重的經濟損失[3]。為了解奶牛場的牛副結核發病狀況與凈化效果，大連市畜牧總站從2018年開始到2020年連續3年對大連地區規模奶牛場進行采樣檢測，共采集樣品3070份，對采集的樣品進行了血清學檢測?，F將檢測情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

從大連地區多家規?；膛ｐB殖企業（規模奶牛場存欄情況見表1）采集全血樣品，分離血清后于4℃冰箱中保存，備用。

表1 規模奶牛場存欄情況

1.2 試劑

牛副結核抗體檢測ELISA試劑盒（批號為8156），北京愛德士元亨生物科技有限公司生產。

1.3 主要儀器

酶標儀（型號為Multiskan MK3），美國Thermo?Multisk公司產品；96針全自動酶標洗板機（型號為PW-960Plus），深圳市匯松科技發展有限公司產品；生化培養箱（型號為SHP-250），上海森信實驗儀器有限公司產品。

1.4 檢測步驟

1.4.1 樣品稀釋

按照檢測試劑盒的操作步驟，根據對照和待檢血清ELISA板布局，對檢測樣品用樣品稀釋液進行100倍稀釋，對陰陽對照進行20倍稀釋。用微量反應板振蕩器對反應板進行樣品混勻。封板后于24℃溫箱進行孵育1h。

1.4.2 預孵育樣品和抗原結合

取100μL預孵育樣品加入到已包被有抗原的微量反應板中，封板后于24℃溫箱孵育45min。

1.4.3 加酶標抗體

用洗板機對孵育完成的反應板進行洗板5次，于拍板紙上拍干后，加入100μL已進行20倍稀釋的酶標抗體。封板后于24℃溫箱孵育30min。

1.4.4 加底物

用洗板機對孵育完成的反應板進行洗板5次，于拍板紙上拍干后加入100μL底物液。在避光環境下24℃溫箱孵育10min。

1.4.5 加終止液

將孵育完成后的反應板加入100μL終止液，在酶標儀上進行讀數。

2 結果與分析

2.1 檢測結果

2018年共檢測8家規模奶牛場，每場按最低20%的存欄量抽檢，抽檢樣品總數為1767份，檢測結果陽性為142份，陽性率為8.04%。2019年共檢測10家規模奶牛場，每場抽檢樣品數為92份（其中一家抽檢樣品90份），抽檢樣品總數918份，檢測結果陽性為19份，陽性率為2.07%。2020年由于受新冠疫情影響，只對3家規模奶牛場要凈化轉場的犢牛進行全部檢測，檢測樣品總數為385份，檢測結果陽性為32份，陽性率為8.31%。具體檢測結果見表2。

表2 2018—2020年檢測數與檢測結果

2.2 結果分析

通過2018—2019年連續2年對規模奶牛場副結核抗體檢測結果進行對比，可知大連地區規模奶牛場副結核的整體陽性率由8.04 %下降至2.07 %，出現了明顯下降。同時，2年連續參與檢測的8家規?；膛龈苯Y核陽性率均呈下降趨勢,2019年奶牛副結核檢測陽性率明顯低于2018年。分析原因有兩點：一可能與當年副結核病的流行態勢有關；二可能與采取的檢測、隔離、消毒等凈化措施有關。

2020年檢測的3家規模化奶牛場其中有2家是連續3年都進行了檢測，另外1家是2019—2020年2年連續進行檢測，在2020年陽性率均出現了反彈現象。分析原因可能與當年檢測的樣品均為犢牛有關。

通過對表1和表2數據進行分析，結合養殖場飼養管理水平與生物安全控制措施，可以看出飼養管理水平高、生物安全措施管理到位，奶牛副結核的感染率相對較低，反之相對較高。因此，通過檢測、隔離、消毒等綜合防控措施是可以大大降低養殖場奶牛副結核的感染率，尤其是在目前沒有特效治療藥物和疫苗免疫時，通過采取檢測凈化手段及綜合防控措施是控制牛副結核病在場內傳播行之有效的方法。

下一步應持續對大連市的規模奶牛場副結核感染情況進行檢測，并重點對2020年檢測的3家規模奶牛場及凈化轉場的犢牛群進行跟蹤監測，條件允許時再開展副結核細菌的分離培養和分子生物學檢測，以摸清副結核病在奶牛場的感染規律，探索出大連市規模奶牛場副結核病凈化的綜合防控措施與標準。