口蹄疫BHK21轉瓶細胞培養血清加量的研究

王 珍，脫浩亮

（中牧實業股份有限公司蘭州生物藥廠，蘭州 730046）

近年來，隨著口蹄疫疫苗生產工藝的技術升級，已從轉瓶生產工藝全面轉型升級為懸浮培養工藝，但在種毒制備過程中還離不開轉瓶培養工藝，而轉瓶細胞的培養離不開血清，所以血清在口蹄疫疫苗生產的環節中扮演著至關重要的角色。但是血清的市場價格近幾年一直居高不下，而且還呈現出逐年上升的趨勢，為降低生產成本，號召國家節能減排的國策。本研究通過改變轉瓶細胞培養中血清的加量探討口蹄疫轉瓶培養的最佳血清加量。

1 材 料

1.1 種毒、轉瓶細胞及培養基

BHK21轉瓶細胞、口蹄疫O型及A型種毒，均由中牧股份蘭州生物藥廠提供；細胞培養基、1900病毒維持液，由宜興賽爾生物科技有限公司提供。以上材料均為保質期內正常材料。

1.2 試驗動物

2～3日齡、正常生活的昆明系健康乳鼠，體重6～8g，由蘭州生物藥廠四車間飼養人員提供。

1.3 儀器與設備

15L玻璃細胞瓶、轉瓶機、超速離心機（型號為Beckman_L-100XP），均由蘭州生物藥廠配備。

2 方 法

將生長良好的轉瓶細胞充分消化后，平均分成8份，分別加入血清含量為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的細胞培養液，按1∶5比例進行分種，置37℃的轉瓶機中培養48h，觀察細胞生長情況并做詳細數據記錄。

將培養48h的轉瓶細胞消化后，再加入相應血清含量的細胞培養液，按1∶5比例進行分種，置37℃的轉瓶機培養48h，觀察細胞生長情況并做詳細數據記錄，使其連續傳代5代。

將第5代培養48h不同血清含量的轉瓶細胞棄去細胞廢液，分別將含有5%口蹄疫O型及A型種毒的1900維持液加入細胞瓶，每瓶500mL，觀察細胞病變情況并記錄詳細數據，待細胞病變達90%后收獲[1]。

按照“口蹄疫疫苗生產檢驗規程”，用2～3日齡乳鼠檢測收獲病毒的半數致死量（LD50）。利用乳鼠進行疫苗效力檢驗，計算病毒的LD50。操作方法包括:在三級生物安全防護實驗室將口蹄疫病毒不同梯度稀釋后接種乳鼠，規定時間內統計小鼠死亡數，根據特有的公式計算病毒的LD50。

按照“口蹄疫疫苗生產檢驗規程”，用蔗糖密度梯度離心法檢測口蹄疫病毒完整顆粒（146s）含量。口蹄疫病毒完整顆粒（146s）作為疫苗免疫時發揮作用的主要免疫原，在生產、儲存、運輸等任何環節中的不同程度的降解都會引起動物機體免疫后效力下降。按照蔗糖密度梯度超速離心法對口蹄疫病毒146s進行分離純化，同時利用紫外分光光度計在259nm處檢測吸收峰，并利用自動化電腦軟件系統對吸收峰面積進行計算，從而得出口蹄疫病毒粒子146s的含量。目前該方法仍然是各大口蹄疫滅活疫苗生產企業對各生產環節中146s含量檢測的主要技術。該方法也可用于成品苗中口蹄疫病毒146s抗原含量的測定[2]。

3 結果與分析

3.1 口蹄疫O型病毒轉瓶細胞血清加量的影響

當血清加量在3%～5%時，LD50及146s較為理想，細胞形態良好，病變時間適中，結果見表1。

表1 口蹄疫O型病毒轉瓶時細胞血清加量的影響

3.2 口蹄疫A型病毒轉瓶細胞血清加量的影響

當血清加量在3%～5%時，LD50及146s較為理想，細胞形態較好，病變時間適中，結果見表2。

表2 口蹄疫A型病毒轉瓶時細胞血清加量的影響

4 討論與小結

在口蹄疫疫苗種毒生產過程中，轉瓶細胞血清加量在3%以上時，細胞生長48h均能形成致密的單層，細胞形態良好，接毒后細胞病變時間較為穩定，病毒LD50及146s無明顯差別。而轉瓶細胞血清加量在2%以下時，細胞生長48h未能形成致密的單層，細胞形態較差，接毒后細胞病變時間縮短，病毒LD50及146s含量較低。因此在口蹄疫疫苗轉瓶種毒生產過程中，應結合轉瓶種毒LD50及146s結果、生產成本等因素綜合考慮，以確定BHK21轉瓶細胞培養血清的加量[3]。

綜上所述，口蹄疫BHK21轉瓶細胞培養的血清加量控制在3%～5%時較為理想，能達到試驗要求又能滿足節能減排。

另外值得關注的是，轉瓶細胞血清的加量還取決于細胞培養基的營養，如果細胞培養基的營養更為充足，則血清的加量還有可能降低，有待于進一步探索。