牡丹籽粉對雌性小鼠生理指標的影響及其排泄規律研究

孫啟亮，張惠喜，宋紅衛，高英莉，肖 猛，魏戎蓉，朱 山，袁國良

（菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000）

牡丹籽為芍藥科芍藥屬牡丹結的種子，是我國寶貴的民族藥材資源，在藏藥中可用于治療皮膚病、炭疽和高燒，民間多用于治療腰腿疼痛[1]。牡丹籽中含有芍藥苷[2]、單萜糖苷[3]、白藜蘆醇[4]等活性成分，具有抗菌、消炎、調節免疫等多種藥理作用。而且，部分單萜苷類和芪類化合物為牡丹籽所獨有，但藥理作用未知，具有較高的研究價值。牡丹籽是一種特殊的中藥材，除藥用外，從中提取的牡丹籽油含有高比例不飽和脂肪酸[5]，具有較高的營養價值和保健價值[6]。2011年中華人民共和國衛生與健康委員會將牡丹籽油批準為新資源食品，這也使牡丹成為一種新型經濟作物。牡丹籽粉是牡丹籽榨油后的副產物，可作為芍藥苷的提取原料[7]；牡丹籽中蛋白質含量豐富，也可作為新型蛋白飼料來源[8]。合理開發牡丹籽資源，可以實現牡丹由單純的觀賞功能向經濟作物功能延伸，對形成更加細分的牡丹產業鏈、提高牡丹種植者的收入具有重要意義。

本試驗以雌性昆明種小鼠為研究對象，分別采用長期連續灌胃和一次性灌胃處理的方式，測定小鼠體重、臟器濕重、血清生化指標、血常規指標及排泄物中芍藥苷含量等，評估牡丹籽粉對小鼠生理指標的潛在影響及排泄規律，以期為牡丹籽的合理利用提供基礎數據支持。

1 試驗材料

1.1 牡丹籽粉

牡丹籽粉，購自菏澤天寶牡丹生物科技有限公司，于4℃冰箱中保存，備用。

1.2 試劑與儀器

天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、谷氨酰轉肽酶（GGT）試劑盒、總膽紅素（TBil）試劑盒、總膽固醇（CHOL）試劑盒、總三酰甘油（TG）試劑盒、總蛋白（TP）試劑盒、白蛋白（ALB）試劑盒、肌酸激酶（CK）試劑盒、尿素（Urea）試劑盒、葡萄糖（GLU）試劑盒及鉀（K）、鈉（Na）、氯（Cl）試劑盒，均購自北京豪邁生物科技股份有限公司；芍藥苷標準品（純度98.8%），購自Stanford Analytical chemicals公司；高效液相色譜儀（e2695），Waters公司產品；全自動生化分析儀（Humastar600），Human公司產品；血細胞分析儀（BC-5000vet），Mindray公司產品。

1.3 試驗動物

昆明種小鼠，SPF級，雌性，42只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。適應飼養1周，環境溫度控制在20～26℃，相對濕度為40%～70%，維持12h光照，非灌胃期間自由采食全價日糧，每日觀察小鼠健康狀況。

2 試驗方法

2.1 試驗動物分組與處理

30只昆明種雌性小鼠按體重隨機分為5組，分別為空白組、低劑量組（1.25 g·kg-1體重）、中劑量組（2.5 g·kg-1體重）、高劑量組（5.0 g·kg-1體重）和溶劑對照組。空白組自由飲水、采食，不作灌胃處理；將牡丹籽粉分別以0.5%羧甲基纖維素鈉為溶劑稀釋成相應劑量的混懸液作為劑量組；溶劑對照組按等體積灌胃法以0.5%羧甲基纖維素鈉作灌胃處理。灌胃1次·d-1，持續8周。

2.2 生理指標測定

2.2.1 體重及臟器濕重

于試驗開始當天對小鼠稱重，之后每周稱重1次，記錄好數據。灌胃8周后觀察小鼠的采食、飲水、發病及死亡等情況，解剖分離小鼠胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、卵巢、子宮等主要臟器進行稱重，計算臟體比，臟體比=臟器濕重/單位體重[9]。

2.2.2 血清生化指標和血常規指標

用眼眶采血法分離血清和全血，血清用于測定AST、ALT、ALP、GGT、TBil、Urea、TP、ALB、CHOL、GLU、CK、TG、K、Na、Cl；全血用于測定白細胞（WBC）、嗜中性粒細胞百分數（Neu%）、淋巴細胞百分數（Lym%）、單核細胞百分數（Mon%）、嗜酸性粒細胞百分數（Eos%）、嗜堿性粒細胞百分數（Bas%）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、血細胞比容（HCT）、紅細胞平均體積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白含量（MCH）、血小板計數（PLT）。

2.3 牡丹籽粉排泄規律研究

2.3.1 牡丹籽粉中芍藥苷的提取與凈化

稱取牡丹籽粉樣品1g，置于250mL錐形瓶中，以料液比1∶20加入70%乙醇溶液，浸泡1h，超聲提取10min。靜置，取上清液稀釋后過0.22 μm濾膜供液相色譜檢測。

2.3.2 牡丹籽粉中芍藥苷的排泄及消除規律

將12只昆明小鼠隨機分為4組，單籠飼養，分別為空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。按生理指標測定試驗設計的劑量一次性灌胃給予牡丹籽粉，分別在試0～12、13～24h依次間隔12h收集糞便和尿液至灌胃后72h，將每次收集到的小鼠糞便稱重、研細、混合均勻后置于250mL錐形瓶中，余下操作同牡丹籽粉中芍藥苷的提取與凈化。將每次收集到的小鼠尿液置于10mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，混勻，稀釋后取上清液過0.22 μm濾膜供液相色譜檢測。排泄率=檢出量/總檢出量；消除率=（總灌胃量-總檢出量）/總灌胃量。

空白組小鼠不予灌胃，分別收集糞便和尿液作為空白樣。灌胃后小鼠自由采食和飲水。

2.4 色譜條件

色 譜柱 為Agilent Eclipse XDB-C18，5μm，250mm×4.6 mm；流動相為甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（40∶65V/V）；檢測波長為230nm；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為10μL；柱溫：30℃。

2.5 統計學分析

利用IBM SPSS Statistics22軟件對試驗數據進行t檢驗和單因素方差（one-way ANOVA）分析，結果用“平均值±標準差”表示。

3 結果與分析

3.1 生理指標的測定

3.1.1 小鼠體重變化情況

體重數據見表1。

分別將低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠體重與相應周次的空白組小鼠體重相比，由表1可知，各組數據差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 試驗小鼠各階段的體重 g

3.1.2 臟體比測定

試驗結束后解剖小鼠，各組小鼠胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、卵巢、子宮組織均未見明顯異常。臟體比結果見表2。由表2可知，灌胃8周后，小鼠低、中和高各劑量組與空白對照組小鼠的臟體比數據之間差異均無統計學意義（P＞0.05），表明經口灌服的牡丹籽粉對小鼠臟器沒有顯著影響。

表2 各組試驗小鼠的臟體比

3.1.3 小鼠血清生化指標

血清相關生化指標檢測結果見表3。雌性小鼠經灌胃8周后測定的15項生化指標與空白組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組試驗小鼠的血清生化指標

3.1.4 小鼠血常規指標

采集各組小鼠血液用肝素鈉抗凝，進行血常規檢測，結果見表4。

表4 各組試驗小鼠的血常規指標

與空白組相比，各劑量組測定的12項血常規指標差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.2 排泄規律研究

3.2.1 芍藥苷的線性范圍、回歸方程、檢測限及定量限

取芍藥苷標準貯備液適量，用流動相稀釋成濃度為10、20、50、100、200μg·mL-1的標準工作液，進行HPLC測定，每個濃度的標準工作液測定3次，10μg·mL-1芍藥苷標準品色譜圖見圖1。

圖1 芍藥苷的標準色譜

將各濃度與對應峰面積均值作線性回歸，即得線性方程。結果表明，標準溶液線性范圍在10～200μg·mL-1時，其線性方程為：y=1.31 ×104x+6.16 ×103（r2=0.999064 ）。通過測定信噪比（S/N）確定其檢測限（S/N=3）。芍藥苷在尿液和糞便樣品中的最低檢測限分別為1.15 mg·kg-1、0.588 mg·L-1。

3.2.2 回收率與精密度

分別向空白組小鼠糞便和尿液樣品中加入適量標準溶液，使芍藥苷濃度分別為5、10、20μg·mL-1，按照樣品制備方法處理后經HPLC檢測。回收率采用回歸方程擬合計算。每個濃度5個平行，計算相對標準偏差。芍藥苷在小鼠尿液和糞便中的回收率見表5，可見芍藥苷回收率為73%～100%，相對標準偏差為0.35 %～10.85 %，滿足定量分析方法的需要。

表5 芍藥苷在小鼠糞便和尿液中的回收率 %

3.3 芍藥苷的消除規律

小鼠一次性灌服牡丹籽粉后，在給藥0～72h時間段的尿液中芍藥苷含量均在檢測限以下；在糞便中的檢出數據及排泄率、消除率見表6～表7。

由表6～表7可知，在0～24h和25～48h內均能檢測到芍藥苷，48～72h內的數據在檢測限以下。

表6 一次性灌服牡丹籽粉后糞便中芍藥苷的檢出量及排泄率

表7 芍藥苷總灌胃量及消除率

4 討 論

4.1 生理指標測定

連續灌胃8周后，雌性小鼠空白組胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、卵巢、子宮等器官的臟體比指標和血清AST、ALT、ALP、GGT、TBil、Urea、TP、ALB、CHOL、GLU、CK、TG、K、Na、Cl含量水平以及血液WBC、Neu%、Lym%、Mon%、Eos%、Bas%、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、PLT水平與對照組相比均無統計學意義。這些結果說明牡丹籽粉對雌性小鼠的生長性能無影響，對臟器無損傷。

試驗動物生理指標是反映動物生長性能的參考指標，也是評估臟器功能的基礎依據[10]。在肉雞基礎日糧中分別按5%、10%的比例添加牡丹籽粕，與基礎日糧組相比，肉雞日采食量顯著降低而平均日增重和血生化指標以及血常規指標無顯著差異，提示此劑量的牡丹籽粕可提高飼料利用率，且此劑量下肉雞臟器未見損傷[11]。由于牡丹籽中含有的多糖具有良好的抗氧化性能[12]，試驗組日糧中含有的牡丹多糖對臟器的保護作用與生理指標變化的相關性尚需試驗進一步驗證。

4.2 牡丹籽粉排泄規律

牡丹籽含有多種活性化合物，包括單萜苷類、低聚芪類、鞣質類、三萜和甾體類、黃酮類、丹皮酚類、多糖等。這些化合物以芍藥苷含量相對最高，且含有的芍藥苷類似物多達十幾種[13]，所以芍藥苷可以作為標志物用來評估牡丹籽粉在小鼠體內的排泄規律。經一次性灌胃后排泄物中檢測到的芍藥苷總量結果顯示，低、中、高劑量的牡丹籽粉排泄率在0～24h之內均在90%以上，在49～72h之內完全排泄；各劑量組中芍藥苷經代謝消除的比例分別為76.2 %、54.0 %和54.5 %，提示隨著灌胃劑量從中劑量提高到高劑量，芍藥苷的消除率未發生變化，可能原因是牡丹籽粉蛋白質含量豐富[14]，對芍藥苷的代謝產生了保護效應。

5 小 結

本試驗采用長期連續灌胃和一次性灌胃的方式分別采用不同劑量（1.25 、2.5 、5.0 g·kg-1體重）牡丹籽粉處理小鼠，用小鼠體重、臟體比、血清生化指標、血常規等參數進行評估，用糞便和尿液中芍藥苷的含量對牡丹籽粉的排泄規律進行初步研究，發現牡丹籽粉對雌性小鼠的生長無影響，其對雄性小鼠的影響尚需要進一步研究。