可利霉素對臨床分離菌的體內外研究

何苗 程琳 李丹宇 吳喜成 谷普慶鄭歆周黎明△

（1. 四川大學華西基礎與法醫學院藥理教研室 四川 成都 610041；2. 沈陽同聯集團有限公司 遼寧 沈陽 110042）

可利霉素（Carrimycin，商品名必特）是中國醫學科學院醫藥生物技術研究所與沈陽同聯集團有限公司共同開發的國家一類新藥，于2019年6月獲批上市。可利霉素是根據細菌耐藥特點進行設計，通過導入外源基因進行催化形成異戊酰基側鏈的生物合成藥物。是多組分小分子化合物的混合物。其主要成分包括異戊酰螺旋霉素Ⅲ、異戊酰螺旋霉素Ⅱ、異戊酰螺旋霉素Ⅰ三個主要成分（見圖1）及一定量的丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素Ⅲ、丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素Ⅱ等9種成分組成的混合化學物[1]，其結構屬于大環內酯類抗菌藥物。可利霉素可阻斷50s 核糖體中肽酰轉移酶的活性來抑制細菌蛋白質合成，從而達到抑菌作用，并且可利霉素可結合過氧化物清除酶，誘導過氧化物破壞DNA等生物大分子，從而達到殺菌的作用。此外可利霉素在體內還可促進中性粒細胞遷移于炎癥部位，破壞并吞噬細菌及受損細胞，還可增強巨噬細胞的吞噬作用，從而增強機體抗感染作用。藥物代謝動力學研究證實[2-3]它比螺旋霉素體內半衰期更長，部分代謝產物仍然保持抗菌活性；組織滲透性增強，還具有明顯的抗生素后效應。但是前期研究表明可利霉素體內抗菌作用較強，但是體外抗菌作用對有些細菌有效，而對有些細菌作用較弱，本研究的目的是進一步明確可利霉素對臨床分離鮑曼不動桿菌和部分耐藥菌的體內外的抗菌作用。

圖1 可利霉素的主要成分結構示意圖

1 實驗材料和實驗方法

1.1 實驗材料

藥品：可利霉素，由上海同程制藥公司提供，批號：CA1601015R； 臨床分離株：臨床分離鮑曼不動桿菌200株，耐喹諾酮大腸埃希菌、耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯銅綠假單胞菌、耐甲氧西林的葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,，MRSA）各1株。菌種來源：菌株均為2016年6 月至2019年4月在四川成都地區收集的臨床分離致病菌。在收集單位經VITEK-60自動微生物鑒定儀鑒定。每株細菌在實驗前經瓊脂平板劃單菌落分純，37℃隔夜新鮮培養的菌體適當稀釋用于實驗。動物：昆明小鼠，雌雄各半，體重18-22 g，購自成都達碩實驗動物有限公司（SPF級）。飼養條件：25℃，濕度60%。飼養條件為SPF級，研究過程遵從實驗動物飼養管理和使用指南。小鼠由成都達碩生物科技有限公司提供，生產設施許可證：SCXK（川）2008-24。

1.2 實驗方法

1.2.1 體外細菌MIC測定[4，5]

將平皿上的單個細菌接種至液體培養基，24 h后，吸取適量該菌液用麥氏比濁管測定濃度，調整濃度至2×107CFU?mL-1，作為工作菌液，此菌液盡量在15 min內接種完畢。配制藥物：取可利霉素0.0205g，加無水乙醇和吐溫80各600 μL，加入LB培養基2.8 mL，得5.12 mg?mL-1藥物原液。其它藥物根據預試驗取不同濃度對倍稀釋。細菌接種：1-13號管為含藥培養基，每管的接種菌液量為5μL，故最終每管中約含接種菌量105 CFU?mL-1，第14、15號離心管內只加入LB培養基2 mL，第14號離心管為不含藥物的空白對照。第15號離心管為不含藥物和細菌的純培養基對照管。所有培養管置恒溫箱中于35-37℃培養18 h后觀察結果。以不生長細菌的培養管為該細菌的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。實驗方法和結果判讀參考美國臨床實驗室標準化研究協會(Clinical and laboratory standards institute, CLSI) M100-S25標準。藥物濃度小于2--8 mg?mL-1，大于16--32 mg?mL-1為耐藥。

1.2.2 體內ED50測定[4]

預試實驗，找出引起小鼠100% 死亡的最低菌量：將平皿上的細菌接種至液體培養基，小鼠分為若干組，每組5只，雌雄兼用菌液稀釋至不同濃度，腹腔注射，每只0.5 mL觀察7 d，記錄死亡數。用1倍最大致死量（Maximum lethal dose，MLD）菌量感染小鼠1 h后，不同濃度藥物灌胃，給藥體積0.2 mL?(10g)-1，觀察24 h，記錄死亡數。正式實驗：設計體內治療保護實驗的給藥劑量，小鼠分為若干組，每組10只，雌雄兼用。用1 MLD菌量感染小鼠1 h后，根據預實驗確定的藥物劑量，以1:0.7或1:0.8的濃度間距設置組別，給藥體積0.2 mL?(10g)-1；觀察14天，記錄小鼠死亡數。根據DAS ver1.0軟件BLIESS法計算ED50值。

2 結果

2.1 可利霉素對臨床分離200株鮑曼不動桿菌的MIC

可利霉素在體外對臨床分離的200株鮑曼不動桿菌的MIC值很高，根據判斷原則，為不敏感，見表1。

表1 可利霉素對臨床分離200株鮑曼不動桿菌的MIC值

2.2 可利霉素對臨床分離耐藥菌的MIC

臨床分離的耐藥菌，包括耐喹諾酮大腸埃希菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯銅綠假單胞菌、耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌、耐甲氧西林的金色葡萄球菌對可利霉素的均不敏感，見表2。

表2 可利霉素對臨床分離耐藥菌的MIC值

2.3 可利霉素作用于小鼠的ED50

在體內對耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌ED50為112.2 mg?kg-1；對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的ED50為153.2 mg?kg-1；初步認為可利霉素對耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌在體內有一定的抗菌作用，見表3。

表3 可利霉素對各耐藥菌的ED50結果

3 討論

可利霉素首次獲批適應癥：①下呼吸道感染：流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌引起的急性氣管-支氣管炎；②上呼吸道感染：由肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、化膿性鏈球菌、卡他莫拉菌以及葡萄球菌引起的急性鼻竇炎。但在實驗中我們發現在體外，可利霉素對鮑曼不動桿菌不敏感，但在體內對耐藥的鮑曼不動桿菌有較好的作用（ED50較低）。鮑曼不動桿菌[6]屬于非苛養菌，生存能力較強，在臨床各類標本和醫院環境中檢出率很高，容易引起院內感染且迅速通過污染的器械和醫務人員手等媒介進行傳播，甚至引起院內感染暴發。

近年來經過抗菌藥物專項整治，抗菌藥物合理應用得到逐步改善，但碳青霉烯類抗菌藥物使用量持續增加，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌檢出率增加，2017年CHINET顯示檢出率達到接近70%[7]。

耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌常在危重患者中檢出，極易在患有嚴重基礎疾病、年老、抵抗力低下住院患者的呼吸道、燒傷創面、皮膚、口腔及泌尿道等部位定植，可引起包括呼吸系統、泌尿系統、血流系統等幾乎所有系統的感染，死亡率可以達到50%以上[8]。

耐藥的鮑曼不動桿菌對常用抗菌藥物的敏感率均＜30%，僅對多粘菌素和替加環素較為敏感，為此，尋找對泛耐藥鮑曼不動桿菌有效的抗菌藥物有十分重要的臨床意義。盡管我們的研究還未找到可利霉素在體內對鮑曼不動桿菌有效，而在體外幾乎沒有作用的原因。我們相信，進一步的研究，終將解決這一問題。

近期的研究發現，可利霉素不僅對細菌有殺滅作用， Haiyan Yan等人[9]的研究認為可利霉素對COVID－19的RNA復制有抑制作用，在對200個現有的臨床使用藥物進行抗COVID－19體外篩選，發現可利霉素的抗冠狀病毒作用最強。劉少華等人報道，在2020年武漢新冠流行的時候，可利霉素單用或聯合抗病毒藥物治療的2例新冠肺炎患者的發熱、咳嗽、乏力等臨床不適癥狀明顯緩解，肺部CT顯示感染較前明顯改善，2次新型冠狀病毒RNA檢測轉陰，臨床治愈并順利出院。 Si-yuan Liang[10]報道，可利霉素能夠在體內和體外抑制口腔鱗狀細胞癌的生長，其機制可能與調節PI3K/AKT/mTOR and MAPK通路有關。

我們相信，隨著可利霉素的臨床使用和研究更加廣泛，可利霉素新的臨床適應癥將會有更多的拓展。