基于網絡藥理學與分子對接技術探討四君子湯治療IBS－D的分子靶點與作用機制研究

牛媛媛，汪龍德，毛蘭芳，2，胥文娟，3，張萍，符博雅

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730020；3.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一種較為普遍的功能性胃腸道疾病，根據糞便的突出形式進一步分為腹瀉型、便秘型和混合型。其中患病率較高的是腹瀉型腸易激綜合征（Diarrhea－predominant irritable bowel syndrome，IBS－D），有研究表明IBS－D的進展與直腸急迫、頻率增加、壓力相關腹脹和稀水樣便有關［1］。IBS－D 的患病率約占該類疾病的1/3 以上［2］，據有關數據統計，北美成年人IBS－D 的患病率約為10%～12%，且在50 歲以下的女性患者中較為常見［3］。我國IBS－D 患病人數占消化病科IBS 門診人數的半數以上，IBS－D 致病因素多樣且復發率高，給患者的生活帶來嚴重困擾［4］。

中醫學中沒有腹瀉型腸易激綜合征這一現代醫學病名記載，根據其臨床表現及病理特征，多將其歸為“泄瀉”“下注”“鶩溏”等范疇。致病因素不外乎外感六淫、七情內傷、飲食不調等方面，病機關鍵為“脾虛不運，濕困脾土”，治宜益氣健脾滲濕止瀉。益氣健脾的代表方四君子湯論治IBS－D 的理論淵源可考于《太平惠民和劑局方》卷三，書中記載：“心腹脹滿，全不思食，腸鳴泄瀉，嘔噦吐逆，大宜服之”。基于此，本研究通過網絡藥理學結合分子對接手段，預測四君子湯干預IBS－D 的效應機制，以期為四君子湯的臨床潛在應用價值開發及更深層次的實驗研究提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 篩選四君子湯有效成分

設置口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug－likeness，DL）≥0.18，采用中藥系統藥理學分析平臺數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取“黨參、茯苓、甘草”三味中藥的有效成分，在中藥系統藥理學成分分析平臺BATMAN 數據庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman－tcm/index.php）中設定Score ≥20，對“炒白術”成分及相關靶點進行篩選。

1.2 預測四君子湯的作用靶點與腹瀉型腸易激綜合征的疾病靶點

基于TCMSP 數據庫平臺和BATMAN 數據庫預測得到四君子湯的成分靶點，進一步深入探索并提取相應成分的作用靶點，選擇Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）獲取基因注釋文件。利用GeneCards 數據庫（http：//www.genecards.org/），以“Diarrhea predominant irritable bowel syndrome”為關鍵詞搜索，得到疾病相關的基因文件，構建藥物靶點與疾病靶點交集，獲得四君子湯與疾病IBS－D 的交集靶點文件，即四君子湯治療IBS－D的潛在作用靶點。

1.3 構建“藥物－成分－靶點－疾病”網絡

將“1.2”中相關藥物與疾病的基因交集進行數據軟件的輸入，利用Cytoscape 3.8.0軟件進行“藥物－成分－靶點－疾病”網絡可視化的構建，而后進行網絡圖節點的分析，常規選用CytoNCA 插件同時將type 文件進行輸出，對每個代表藥物、疾病或者有效成分、靶基因屬性的節點進行標注與說明，其中輸出的molLists文件則代表分子屬性的有效成分，即四君子湯治療IBS－D的有效成分。

1.4 蛋白－蛋白相互作用網絡的構建與分析

利用TRING 11.0 軟件（http：//string－db.org）將“1.3”中獲得的藥物－疾病交集靶基因文件進行數據導入，并將“homo sapiens”作為物種限定。進而將置信度高于0.95 的數據優先選取，完整構建中藥復方制劑四君子湯的蛋白相互作用PPI 網絡，最后根據網絡中基因與鄰接基因的數目，確定該網絡中的核心基因。

1.5 GO和KEGG富集分析

將“1.4”研究所得PPI 網絡中的靶點蛋白進行匯總，GO 分析與通路KEGG 分析可選擇使用R 語言bioconductor 包（http：//www.bioconductor.org/）分別進行，篩選結果生成圖表以進行可視化結果判讀分析。

2 結果

2.1 四君子湯活性成分的篩選

通過TCMSP 數據庫和BATMAN 數據庫進行數據檢索并得到四君子湯有效成分共計133個。TCMSP 數據庫中以“OB ≥30%和DL ≥0.18”為條件篩選后得到甘草92 個，茯苓15 個，黨參21 個；BATMAN 數據庫得到炒白術5個。

2.2 四君子湯作用靶點與IBS－D疾病靶點信息

利用TCMSP 數據庫預測得到的四君子湯成分靶點經Uniprot 數據庫基因注釋后得到的Symbol 文件共290 個注釋基因；通過GeneCards 數據庫檢索后得到1 913個與IBS－D相關的基因。取四君子湯與IBS－D疾病的交集靶點，共獲得196個交集基因。見圖1。

圖1 藥物成分與疾病的交集基因

2.3 “藥物－成分－靶點－疾病”網絡

利用Cytoscape 3.8.0 繪制四君子湯治療IBS－D的“藥物－成分－靶點－疾病”網絡圖。見圖2?！盎衔铮悬c－疾病”網絡共含有400 個節點和1 972 條邊。通過CytoNCA 分析發現四君子湯中前十位的活性成分為：7－甲氧基－2－甲基異黃酮（7－Methoxy－2－methyl isoflavone）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、刺果甘草查耳酮（glypallichalcone）、芒柄花黃素（formononetin）、柚皮素（naringenin）、美迪紫檀素（medicarpin）、異鼠李素（isorhamnetin）、光甘草定（glabridin）、豆甾醇（stigmasterol）。見表1。

圖2 四君子湯“藥物－化合物－靶點－疾病”網絡調控圖的構建

表1 四君子湯治療IBS－D的關鍵化合物（前十位）

2.4 構建PPI網絡

將“2.3”中規范化后的共有靶點基因輸入STRING網站，基因類型選擇人類（homo sapiens）并設置最小關系值≥0.95，刪除無連接節點，生成藥物－疾病共有靶點PPI 網絡。見圖3。將結果導出，輸入Cytoscape 3.8.0 軟件，進行拓撲參數分析，得出PPI 網絡共13 個節點，53 條邊，其中度值排名前十位的靶蛋白為JUN、STAT3、MAPK3、MAPK1、FOS、RELA、MYC、IL6、TP53和IL2。

圖3 “四君子湯－腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點蛋白互作網絡圖

2.5 靶蛋白的富集分析

2.5.1 GO富集分析

將藥物－疾病共同靶點輸入R 語言bioconductor包中，分別進行分子功能（GO molecular functions）、生物途徑功能（GO biological processes）和細胞成分（GO cellular components）三個方面的GO 富集分析，取排名前十位的條目制作條形圖，條形越下P 越小。見圖4。GO 富集分析網絡涉及的分子功能（MF）主要包括類固醇激素受體活性、轉錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合和信號受體激活因子的活性等方面。GO 富集分析網絡涉及的細胞成分（CC）主要與膜微結構域、胞外基質膠原、小凹等細胞組分有關。GO 富集分析網絡涉及的生物過程（BP）主要體現在氧化應激反應、脂多糖、類固醇激素反應、腺發育、細胞的化學應激反應等途徑。

圖4 “四君子湯－腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點的GO富集分析

2.5.2 KEGG通路分析

將藥物－疾病共同靶點輸入R 語言bioconductor包中，選取P較小、Count數較大的前30個通路，利用氣泡圖進行可視化。見圖5。X 軸是P 的大小，Y 軸是通路名稱，氣泡圖的大小代表Count 數目，顏色越深代表P 越小。由KEGG 富集分析結果可知，四君子湯治療IBS－D 的作用途徑與信號通路是復雜多樣的，最有可能與糖尿病并發癥中的AGE－RAGE信號通路、前列腺癌通路、脂質與動脈粥樣硬化通路、乙肝通路、IL－17信號通路和卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染等作用途徑相關。

圖5 “四君子湯－腹瀉型腸易激綜合征”共同靶點的KEGG通路分析

2.6 分子對接

分子對接是目前已知并常規選擇來進行預測配體與已知三維結構蛋白結合性的技術，本研究將PPI 網絡中發現的度值排名靠前的三個靶點蛋白進行分子對接，分子模擬對接的具體結果可由AutoDock 軟件產生，通常意義上認為配體與分子在結合過程中能力需求越低，則二者之間對接成功率越高，易發揮生物效應，同時有助于成功結合后構象的穩定維持，若結合能< 0 kJ/mol 則認為配體與靶蛋白可自行結合。見表2。

表2 四君子湯度值前三位活性成分與靶點蛋白結合能

取degree 值位列前三的蛋白質與化合物結合進行可視化處理。見圖6。結果顯示，各化合物與蛋白對接的結合能均<0 kJ/mol，說明各化合物與各蛋白均能較好結合。

3 討論

益氣健脾之基礎方四君子湯由人參（目前臨床治療多采用黨參替代）、茯苓、炒白術、炙甘草四味甘溫和緩之品組成，方簡力專，為治療脾胃虛弱型腸易激綜合征的常用方劑之一。本研究篩選出四君子湯有效活性成分133 個，可作用于IBS－D 的作用靶點196 個，這與中藥復方制劑多成分、多靶點干預疾病的特性相吻合。腦腸互動異常、免疫功能紊亂、內臟高敏感性、抑郁伴焦慮、腸道菌群失調、胃腸動力異常以及腸道黏膜屏障損傷等致病因素與IBS－D 的發病具有相關性，提示調節腸道免疫系統功能、改變腸道通透性與微生物群可能是干預IBS－D 的重要方向之一［5］。有研究發現，四君子湯在改善腸道運動與吸收功能、修復腸道黏膜屏障損傷、調節腸道菌群數量及豐度等方面均顯示出良好的干預作用［6－8］。由此可見，四君子湯治療IBS－D 的作用機制可能與調節腸道微生態、恢復腸道黏膜免疫功能、修復機械屏障損傷有關。

本研究對四君子湯的有效成分進行了篩選，發現排名靠前的分別是7－甲氧基－2－甲基異黃酮（7－Methoxy－2－methyl isoflavone）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）和刺果甘草查耳酮（glypallichalcone）4 個核心化合物，提示這可能是四君子湯干預IBS－D 的核心藥效成分。TOZLU M 等［9］研究發現，炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）患者在臨床癥狀明顯緩解后，可出現IBS－D 樣癥狀，同時觀察到這部分患者血清中嗜酸性粒細胞增多，提示炎癥反應可能參與了感染后腸易激綜合征（Post－infective irritable bowel syndrome，PI－IBS）過程。山柰酚是一種廣泛存在于不同植物中的天然黃酮醇，已被證實具有強大的抗炎特性，可用于多種疾病的防治研究［10］。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經保護作用［11］。臨床研究亦證實，四君子湯加減論治脾虛型IBS 患者的療效優于馬來酸曲美布汀片組，其作用機制與調節腸黏膜5－羥色胺受體的表達、抑制血清中炎癥的水平有關［12］。本研究結果與文獻報道相類似，在四君子湯干預IBS－D 的靶點蛋白互作網絡中發現炎癥細胞因子白細胞介素－6（IL－6）、白細胞介素－2（IL－2）參與其中，KEGG 通路富集分析結果同樣也提示四君子湯治療IBS－D 的信號途徑與IL－17 信號通路有關。由此可見，四君子湯治療的IBS－D的分子靶點與作用機制可能與調控炎癥信號途徑，抑制炎癥反應激活有關。

JUN 蛋白、信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）為四君子湯干預IBS－D 的潛在優勢靶點蛋白。c－Jun 是二聚體轉錄因子激活因子蛋白－1（AP－1）復合物中研究最廣泛的蛋白分子，且能夠對影響組織生長發育和疾病進展的不同信號進行串擾、放大和整合，從而調控細胞的增殖、凋亡、生存以及腫瘤發生和組織形態的變化［13－15］。STAT3是一種關鍵的信號分子開關，在多種細胞因子和激酶之間的溝通中起著橋梁作用。另一方面，在腫瘤生態系統中，STAT3又可作為調節抗腫瘤免疫反應的中心，影響癌細胞的代謝［16－18］。MAPK1 作為一種可被胞外不同信號刺激激活的絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶在多種癌癥相關的線粒體自噬過程中發揮重要作用［19］。此外，有研究報道超重及過度肥胖與IBS－D 發病之間的關聯性，肥胖型IBS 患者血清中低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）水平的過表達已被證實是影響該類疾病的獨立危險因素，更深層次的理論探究可解釋體重指數（BMI）與肥胖型IBS患者出現腹瀉癥狀之間的關系，即腸道局部炎癥反應引起脂肪吸收改變或腸道微生物組的改變，進而加重或誘發IBS－D［20－21］。有研究發現，小檗堿治療代謝相關脂肪性肝病合并IBS－D 的療效確切，可明顯減少患者腹瀉次數、降低BMI指數及甘油三酯、膽固醇等水平［22］。上述文獻報道與GO 富集分析中的氧化應激、脂多糖及KEGG 通路富集分析中的前列腺癌通路、脂質與動脈粥樣硬化通路等研究結果相吻合，可見四君子湯治療IBS－D 的作用途徑可能與細胞的增殖與凋亡、腫瘤及糖脂代謝等相關分子蛋白及信號通路密切相關。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學與分子對接技術，預測了四君子湯干預IBS－D 的多成分－多靶點－多通路的效應機制，即四君子湯治療IBS－D 分子靶點及作用機制可能與調節腸道微生態，恢復腸道黏膜免疫功能、修復機械屏障損傷、抑制炎癥反應激活、調控細胞的增殖與凋亡、腫瘤及糖脂代謝等途徑有關。這一結論可為進一步研究提供理論支撐與科學依據。