肉豬體內組織和體液中多西環素含量的相關性研究

余軍軍，藍棋浩，寧 軍，韋 田，梁立杰，孫 堅

（1.溫氏食品集團股份有限公司，廣東新興 527400；2.廣東省畜禽健康養殖與環境控制企業重點實驗室，廣東新興 527400；3.華南農業大學獸醫學院，廣東廣州 510642）

多西環素（Doxycycline，DOX）是由土霉素在6-位脫氧而制成的第二代半四環素衍生物，又名強力霉素或脫氧土霉素，由美國輝瑞制藥廠在上世紀60年代發明[1]。多西環素是廣譜抗生素，對腸球菌、肺炎球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、衣原體、支原體和立克次氏體等具有良好的抗菌效果[2]。因其在體內具有分布廣、長效、高生物利用度和無明顯腎毒性等特點，臨床上廣泛應用于豬、牛、雞和羊的養殖，以治療呼吸道、消化道和泌尿道的細菌性疾病。隨著多西環素在獸醫臨床上的使用，其殘留問題也越來越被重視。目前，國內外對多西環素在動物體內的殘留消除的研究已有很多，但對多西環素在體內的殘留監控主要用動物的可食用組織，尿液和血液中多西環素殘留的消除及殘留監控較少[3-4]。本文通過計算多西環素在豬體內的休藥期，并預測休藥期豬尿液和血液中藥物殘留量范圍，以探索尿液或血液樣品用于多西環素殘留監控的可操作性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備

液質聯用儀（QTRAP 5500，美國AB SCIEX公司）；組織勻漿機（HM6300，北京Lab Precition公司）；氮吹儀（MV5，北京萊伯泰科公司）；電子分析天平（BT125D，德國Sartorius公司）；冷凍高速離心機（5804R，德國Eppendorf公司）；C18固相吸附劑（月旭科技公司）；6cc/200 mg的固相萃取小柱（Oasis HLB，美國Waters公司）。

1.1.2 試劑

多西環素對照品，純度97.2%，批號1-F-4F4-1，美國CATO公司；多西環素-D3對照品，純度97%，批號T291402，加拿大TRC公司；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，購于德國默克公司；正己烷、三氯乙酸為分析純，購于廣州化學試劑廠；鹽酸多西環素可溶性粉，獸藥字190172193，含量10%，批號20191004，購于河北遠征禾木藥業有限公司。

1.1.3 試驗動物的飼養與管理

選擇健康、體重相近的三元雜商品豬41頭（40.5±3.8） kg，隨機分成2組，分別為對照組1頭，試驗組40頭。試驗組在基礎飲水中添加鹽酸多西環素可溶性粉，制成多西環素濃度為50 mg/L的藥液，連續混飲給藥5 d。于停藥后第1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、12 d、15 d和18 d隨機選擇5頭豬只，采集組織（肌肉、肝臟、腎臟、肺臟）和體液（尿液、血液）作為檢測樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

（1）多西環素儲備液（1 000 μg/mL）.準確稱取50.0 mg多西環素對照品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻密封，置-20 ℃冰箱中保存。

（2）多西環素-D3儲備液（100 μg/mL）。準確稱取1.0 mg多西環素-D3對照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻密封，置-20 ℃冰箱中保存。

（3）三氯乙酸（1 mol/L）。準確稱取16.3 g三氯乙酸置于100 mL容量瓶中，加入超純水溶解并定容至刻度，搖勻。

1.2.2 樣品處理

（1）組織。稱取2.0 g勻漿后的組織樣品置于50 mL離心管中，加入50 μL內標溶液（濃度5 μg/mL），靜置5 min。然后加入2 mL水、8 mL乙腈。渦旋混勻后，超聲提取10 min。然后室溫條件下4 000 r/min離心5 min，上清液倒入50 mL離心管中，加入500 mg C18吸附劑，渦旋30 s凈化。再重復離心1次，移取5 mL上清液在50 ℃水浴中氮氣吹干。殘渣中加入1 mL甲醇水（10∶90）、2 mL正己烷，渦旋30 s。室溫條件4 000 r/min下離心10 min，吸取下層過0.22 μm濾膜，待測。

（2）尿液：取5 mL尿液樣品于15 mL離心管中，并加入20 μL內標溶液（濃度5 μg/mL），靜置10 min。將HLB萃取小柱固定在固相萃取裝置上，依次用5 mL甲醇、5 mL超純水活化后，倒入尿液樣品，用5 mL水、5 mL甲醇水（20∶80）淋洗，抽干，5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液。洗脫液在在50 ℃水浴中氮氣吹干，殘渣用1 mL甲醇水（10∶90）溶解，渦旋30 s。樣品過0.22 μm濾膜，待測。

（3）血液。準確吸取500 μL血漿，依次加入20 μL內標（5 μg/mL）、500 μL三氯乙酸溶液，渦旋混勻，10 000 r/min室溫條件下離心10 min，上清液過0.22 μm針頭濾膜，待上機。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條 件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）；流速：0.25 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～2 min，5%～15% B；2～5 min，15%～40% B；5～7 min，40%～95% B；7～7.1 min，95%～5% B；7.1～12 min，5%。柱溫為35 ℃。進樣體積為10 μL。

（2）質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；多反應監測（MRM）正離子模式；離子源溫度550 ℃；電噴霧電壓（IS）5.5 kV；氣簾氣壓力（CUR）、霧化氣壓力（GS1）及輔助氣壓力（GS2）分別為35 kPa、55 kPa和60 kPa。藥物優化的去簇電壓和碰撞能量等質譜參數見表1。

表1 藥物的MRM質譜優化參數

2 結果與分析

2.1 組織中多西環素殘留消除規律

不同時間點各組織中多西環素殘留量見表2。結果顯示，10%多西環素可溶性粉按推薦劑量連續用藥5 d后，多西環素在肝臟和腎臟中的殘留含量最高，在肌肉、肺臟中的含量較低，停藥2 d后，多西環素在肌肉和肝臟的殘留量分別為（99.30±33.84）μg/kg和（104.51±29.20）μg/kg，均低于最高殘留量MRL[5]（肝臟300 μg/kg，肌肉100 μg/kg），停藥3 d后，腎臟中的多西環素殘留量為（350.28±136.12）μg/kg，低于了最高殘留量MRL（腎臟600 μg/kg）。多西環素主要殘留部位在腎臟，各組織中殘留消除的速度較快，在停藥后5 d，組織中均檢測不出多西環素。在停藥8 d采集的5頭豬血液中，只有1份樣品檢出多西環素。

表2 豬停藥后不同時間點體內各組織和尿液中多西環素的殘留濃度量（n=5）

2.2 休藥期計算

按照農業部對多西環素最大殘留限量[5]和歐盟對休藥期計算方法，利用WT1.4軟件按雙單側99%置信區間計算多西環素在豬組織中休藥期[6]。由圖1可知，多西環素在肌肉中的休藥期為10.58 d、肝臟為10.80 d、腎臟為8.13d、肺臟為10.51 d，考慮到給藥方式等因素的影響，建議休藥期為11 d。

2.3 體液中多西環素殘留量相關性研究

通過統計學軟件SPSS，采用統計學軟件SPSS，對雙變量“停藥后體液中多西環素含量”“各組織中多西環素含量”進行相關性分析。由表3可知，停藥后體液中多西環素殘留量與各組織中多西環素殘留量之間的相關系數大于0.85，相關系數的顯著性水平為0.01，體液與各組織中多西環素殘留量之間是高度相關的。

表3 體液與各組織中多西環素殘留量相關性

2.4 組織中藥物殘留量低于MRL時體液中殘留量區間預測

使用SPSS軟件對時間-體液中藥物濃度進行線性分析，并根據建立的模型預測停藥為10.80 d時的體液中藥物濃度區間范圍。結果顯示，當時間為10.80 d時，即肉豬體內組織中多西環素殘留量低于最大殘留限量時，尿液中藥物濃度區間范圍為57.07～252.12 μg/L；血液中藥物濃度區間范圍為2.76～28.68 μg/L。

3 結論與討論

目前，常用的動物體內藥物殘留檢測方法包括微生物法、毛細管電泳法、酶聯免疫法、液相色譜法和液相色譜串聯質譜法等，其中液相色譜串聯質譜法作為唯一確證方法應用最多。龐國芳等[7]采用液相色譜串聯質譜法檢測了體內各組織和體液中多西環素的殘留量，制定了該產品的休藥期為11 d，為藥物的臨床使用提供了數據支持。

注：A：肌肉，B：肝臟，C：肺臟，D：腎臟。

劉欣[3]按體重10 mg/kg的劑量給予鹽酸多西環素顆粒，每天1次，連續5 d，研究多西環素在動物體內的消除規律，結果顯示，停藥后第3天，除1頭豬肝臟組織中的殘留量高于MRL外，其他各組織中藥物的殘留量均低于MRL，同時計算休藥期為12 d[8-9]。而本試驗結果中，停藥后第3天，豬各組織中藥物殘留量均低于MRL，計算休藥期為11 d，翟克影[4]也做了相關研究，除了劑型和給藥方式不同，鹽酸多西環素在豬體殘留分布與消除結果基本相似。

在實際生產中，通過對豬活體尿液樣品的檢測，建立的回歸方程，可以間接判斷豬體內多西環素殘留量是否低于最大殘留限量。20世紀末開始已有不少學者采用這種經典回歸法來預測組織中藥物的殘留濃度，但在研究時均沒有考慮個體間差異，試驗的重復性較差[10]。本文根據停藥后尿液、血液中藥物消除情況，引入置信區間預測，考慮了個體間差異，通過計算發現當動物停藥時間到達休藥期時，尿液中多西環素殘留量區間下限為57.07 μg/L、血液為2.76 μg/L，表明可通過監測體液中多西環素濃度判斷動物體內組織中藥物殘留量是否安全。考慮到尿液樣品獲取更便捷，采取時動物應激更小，動物屠宰前可檢測尿液判斷動物是否符合屠宰要求，判定限為57 μg/L。