GC-MS/MS法測定芹菜中毒死蜱殘留量不確定度評定

王金翠

（黑龍江省天潤檢驗(yàn)檢測研究院有限公司，黑龍江哈爾濱 150009）

近年來，伴隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，農(nóng)藥殘留問題已成為影響人們生活質(zhì)量的重大問題，農(nóng)藥施用后殘存于周圍土壤及水體環(huán)境中，不僅會(huì)毒害藻類、魚類等水生生物，農(nóng)藥原藥或其在動(dòng)物體內(nèi)的代謝物還會(huì)通過食物鏈間接進(jìn)入人體，影響人體健康[1-2]。毒死蜱是一種毒性強(qiáng)、半衰期長，且被廣泛用于芹菜、菠菜等葉菜類蟲害防治的有機(jī)磷類殺蟲劑，芹菜中毒死蜱殘留量的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)限量為不得超過0.05 mg/kg，從近些年國家監(jiān)督抽檢結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，芹菜中毒死蜱超量使用問題屢見不鮮，在實(shí)際的檢測工作中，樣品檢出結(jié)果在國家規(guī)定限量值附近是比較常見的問題，此時(shí)對檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行更為科學(xué)的評價(jià)尤為重要[3-5]。自1999年我國首次將測量不確定度評定納入計(jì)量技術(shù)規(guī)范以來，其在檢驗(yàn)檢測行業(yè)的應(yīng)用逐漸開展，目前，RB/T214—2017、CNAS-CL01：2018等檢測、校準(zhǔn)準(zhǔn)則中均要求在數(shù)據(jù)出現(xiàn)臨界值時(shí)，需要對檢驗(yàn)方法進(jìn)行測量不確定度評定[6-11]。本研究建立的GC-MS/MS法測定芹菜中毒死蜱殘留量的方法，具有較好的選擇性和靈敏度，并可適用于復(fù)雜樣品的分析，在建立檢驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)規(guī)范和指南[12-14]對芹菜中毒死蜱殘留量測定進(jìn)行不確定度評定，確定影響結(jié)果的主要不確定度分量，為檢測數(shù)據(jù)的可靠性提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GC-MS/MS 7000D氣相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；均質(zhì)器，上海精科；離心機(jī)H1850，湖南湘儀；十萬分之一電子天平MS105DU，梅特勒-托利多；AUY120型電子天平，島津菲律賓工廠；移液器（20 μL），Eppendorf。

毒死蜱對照品（純度為99.7%），SITAER；環(huán)氧七氯B對照品（濃度為100 μg/mL，溶劑為正己烷），信陽市中檢計(jì)量生物科技有限公司；乙腈（色譜純），霍尼韋爾；乙酸乙酯（色譜純），霍尼韋爾；無水硫酸鎂、乙酸鈉，天津博納艾杰爾；凈化管（含1.2 g硫酸鎂、0.4 g PSA），天津博納艾杰爾；氯化鈉（優(yōu)級純），默克；芹菜為市售品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取毒死蜱對照品0.010 03 g置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為100 μg/mL的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)使用液。吸取內(nèi)標(biāo)溶液0.50 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為5.00 μg/mL的環(huán)氧七氯B內(nèi)標(biāo)使用液。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。吸取毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中分別吸取0.50 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL和20.00 mL于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

基質(zhì)工作溶液。將空白基質(zhì)溶液氮?dú)獯蹈桑尤?0 μL內(nèi)標(biāo)使用溶液，分別加1 mL的5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶空白基質(zhì)，即得。

1.3 供試品溶液的制備

取芹菜500 g，攪碎均質(zhì)后，混合均勻，精密稱取10 g勻漿試樣于50 mL離心管中，精密加入20 mL乙腈，再加入6 g硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉、1 g氯化鈉，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min。取上清液10 mL于凈化管（含1.2 g硫酸鎂、0.4 g PSA），渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，精密取5 mL上清液，于40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两伞＞芗尤? mL乙酸乙酯復(fù)溶，加入20 μL內(nèi)標(biāo)使用溶液，混勻，過0.22 μm濾膜，待測定。同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

1.4 分析條件

氣相色譜條件。色譜柱：VF1701-ms（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；色譜柱溫度：40 ℃保持1 min，以40 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，再以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持6 min；氦氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件。離子源：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃：溶劑延遲時(shí)間：4 min；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；定性定量離子對見表1。

表1 質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 測量模型

式中：X-毒死蜱的含量，mg/kg；c-試樣中毒死蜱的濃度，ng/mL；V-樣液最終定容體積，mL；m-稱取試樣的質(zhì)量，g；f-試樣稀釋倍數(shù)。

2.2 測量不確定度的來源

根據(jù)建立的測量模型及樣品的測定過程，芹菜中毒死蜱的不確定度引入來源主要為：①對照品及對照品溶液配制urel（S）；②樣品稱量urel（M）；③樣品前處理過程urel（V）；④校準(zhǔn)方法urel（X）；⑤樣品重復(fù)性測定urel（rep）；⑥空白樣品加標(biāo)回收測定urel（R）。

2.3 各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評定

2.3.1 毒死蜱對照品及其配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（S）的評定

對照品及對照品溶液配制過程引入的不確定度由對照品自身不確定度，電子天平稱量引入的不確定度，以及標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋過程所用量器引入。

（1）對照品引入的不確定度ur（S1）。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書得知，測量所用毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.7%，擴(kuò)展不確定度為±2.0%，k=2，按照均勻分布，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）對照品稱量引入的不確定度ur（S2）。根據(jù)《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008）[15]以及方法稱量質(zhì)量，對照品稱量所用天平（十萬分之一）最大允許誤差為±0.000 005 g，按均勻分布，取包含因子稱取的對照品質(zhì)量為0.010 03 g。

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度ur（S3）。標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程的不確定度主要由所用量器的容量允差以及溫度引起體積變化引入。所用玻璃量器按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[16]檢定，其容量允差均符合A級標(biāo)準(zhǔn)。基質(zhì)曲線配制過程使用移液器加入內(nèi)標(biāo)，按照《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）檢定，所用移液器（規(guī)格為20 μL），當(dāng)量取體積為20 μL時(shí)其容量允許誤差為4.0%，容量允差即為20 μL×4.0%=0.000 8 mL。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋配制引入的不確定度

量器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（S3）：

（4）對照品及對照品溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（S）：

2.3.2 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（M）的評定

樣品測定過程中共使用天平（萬分之一）稱量2次，根據(jù)《電子天平檢定規(guī)章》（JJG 1036—2008）以及方法稱量質(zhì)量，天平最大允許誤差為±0.000 15 g，稱取的樣品質(zhì)量分別為10.015 1 g、10.007 4 g，按均勻分布，取包含因子

2.3.3 樣品前處理過程帶來的不確定度urel（V）評定

操作過程所用玻璃量具均為A級，評定過程同2.3.1（3），樣品前處理過程所用量器及具體不確定度計(jì)算見表3。

表3 樣品前處理過程所用量器引入的不確定度計(jì)算表

樣品前處理過程所用量器帶來的不確定度為：

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）

以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測物與內(nèi)標(biāo)物濃度比作為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的平均值作為縱坐標(biāo)，擬合生成線性回歸方程。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按照公式4計(jì)算：

式中：p-試樣連續(xù)測定的次數(shù)；n-標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)；k-回歸系數(shù)；c-試樣平均濃度；c—-標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值；ci-標(biāo)準(zhǔn)溶液各個(gè)工作液濃度；a-標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。其中，SR為標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，是曲線擬合過程主要的不確定度來源，SR計(jì)算見式5：

式中：Yi-標(biāo)準(zhǔn)溶液各個(gè)響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值比值；a-標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；Xi-標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)物濃度比值；b-截距；n-標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)。

本研究用內(nèi)標(biāo)法定量，將標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)樣1次，得到相應(yīng)峰面積之比，結(jié)果見表4。由表4可知，試驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=12.881 7x+0.148 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，將表4中數(shù)據(jù)代入式4、式5，得ur（X）=0.020 58，SR=0.233 9，芹菜樣品測定外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)濃度之比為1.20，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）=0.017 15。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（rep）的評定

樣品測量重復(fù)性測定引入的不確定度為A類評定，取待測樣品，按樣品制備方法重復(fù)進(jìn)行6次測定，不確定度參照式6計(jì)算，測定結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性測定結(jié)果

2.3.6 空白樣品加標(biāo)回收引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（R）的評定

在6份空白樣品中均加入濃度為1 μg/mL的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，按照上述方法測定，毒死蜱的回收率測定結(jié)果見表6。

表6 樣品加標(biāo)回收率

6次回收率測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為S=2.139 7%，回收率平均值R=91.47%，空白基質(zhì)加標(biāo)回收引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算結(jié)果如式7：

2.4 不確定度的合成

影響芹菜中毒死蜱殘留量測定的各不確定度分量中，對照品及對照品溶液配制不確定度最大，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合次之，具體結(jié)果見表7。

表7 檢測過程的相對不確定分量

按照式8合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.5 擴(kuò)展不確定度U及結(jié)果表示

采用GC-MS/MS測定芹菜中毒死蜱殘留量，當(dāng)樣品中毒死蜱含量為0.048 mg/kg時(shí)，其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度=0.048 mg/kg×0.030=0.001 44 mg/kg。根據(jù)JJF 1059.1—2012，在95%的置信水平下，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=0.001 44 mg/kg×2=0.003 mg/kg。因此，毒死蜱殘留量可表示為（0.048±0.003）mg/kg，k=2。

3 結(jié)論

本研究通過對GC-MS/MS測定芹菜中毒死蜱殘留量過程中標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備、樣品的稱量、樣品前處理過程所使用的移液管及容量瓶等量器、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線校準(zhǔn)、樣品重復(fù)性測定，及空白樣品加標(biāo)回收測定等不確定度來源進(jìn)行分析考察，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度最顯著，方法加標(biāo)回收率、樣品前處理過程及重復(fù)性測試也是不確定度引入的主要來源。因此，可通過增加標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)，根據(jù)樣品選擇合理的線性范圍，增加標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程的移取體積和定容體積以減少標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度，同時(shí)也要提高檢測人員試驗(yàn)水平、試驗(yàn)回收率以及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。