關于微生物法測定米粉中維生素B6含量不確定度評估

戴明男

（中紡檢測（福建）有限公司，福建泉州 362000）

維生素B6又可稱之為吡哆素，包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等多個成分，可溶于水，參與人體多種代謝反應。維生素B6是米粉中重要營養組成之一，但因含量處于較低的水平，測定難度較大。《食品安全國家標準 食品中維生素B6的測定》（GB 5009.154—2016）規定了食品中維生素B6的含量測定方法，微生物法為標準第二法，適用于不同類別食品中維生素B6的測定。本文評估了利用GB 5009.154—2016第二法測定米粉中維生素B6含量的不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料

SHP-250型生化培養箱、Thermo酶標檢測儀、多管式旋渦混合器、水浴鍋、0.2 μm無菌濾膜[1]。市售嬰幼兒配方米粉、維生素B6標準品（≥99.0%），檸檬酸鹽緩沖液（pH為4.5）、馬鈴薯酸性磷酸酶、無菌水。

1.2 實驗方法

1.2.1 操作步驟

在250 mL錐形瓶內，放入2.5 g米粉樣品，利用單標線吸量管加入0.05 L檸檬酸鹽緩沖液后、0.025 L馬鈴薯酸性磷酸酶，在多管式旋渦混合器內混合均勻。進而放置在無光照直射的37.0 ℃室溫環境中，孵育60 min，間隔手動振蕩[2]。孵育完畢后，加入0.1 L滅菌水逐級稀釋，在95.0 ℃水浴鍋內振蕩，在短時間內冷卻至室內溫度后過濾、無菌離心取上清液[3]。進而依據GB 5009.154—2016第二法，配制0 mg/100 g、0.002 mg/100 g、0.004 mg/100 g、0.006 mg/100 g、0.008 mg/100 g的標準品溶液。取微孔板條，在30.0 ℃無光照直射條件下孵育。孵育后，在Thermo酶標檢測儀中，選擇630 nm波長，進行吸光度讀取[4]。

1.2.2 測定計算

GB 5009.154—2016第二法規定米粉中維生素B6含量需要依據下式進行計算：

X=C×n×m×0.822 （1）

式（1）中：X為維生素B6含量，C為樣品在標準曲線下讀取的濃度，n為稀釋倍數，m為樣品量[5]。其中維生素B6含量的相對標準不確定度為：

式（2）中：Urel(X)為維生素B6含量的相對標準不確定度，Urel(C)為樣品在標準曲線下讀取的濃度的標準不確定度，Urel(n)為稀釋倍數的標準不確定度，Urel(m)為樣品量的標準不確定度。

2 結果與分析

2.1 樣品稱量引入的不確定度

用電子天平精準稱量樣品2.500 1 g，天平精確度為0.1 mg。由天平鑒定證書可知天平最大重復性誤差為0.15 mg，在稱取量大于0 g但小于50 g時，指示數值誤差為0.1 mg。利用矩陣分布包含因子為的B類不確定性標定，得出標準不確定度為合成標準不確定式則樣品稱量時的相對不確定度為0.080 75/2.500 1≈0.032 30。

2.2 樣品稀釋定容引入的不確定度

上述操作用儀器均為玻璃材質，玻璃材質校準、溫度干擾均對液體體積具有影響，進而引發維生素B6測定偏差。根據最大允許誤差，依據包含因子k為的均勻分布處理方法進行不確定度分量計算，可得出5 mL單標線吸量管最大允許誤差為±0.015，不確定度為0.008 66，相對不確定度為0.001 68；而250 mL單標線容量瓶最大允許誤差為±0.15，不確定度為0.086 6，相對不確定度為0.000 339，合成剝離器具校準引入的不確定度分量為

考慮到微生物測定區域溫度變化幅度在5.0 ℃左右，水膨脹系數為0.000 21 ℃，依據包含因子k為的矩形分布計算可知，因室溫變化而引起的相對標準不確定度為合成溫度變化引起的操作用儀器相對不確定度分量可得出結果為0.000 857 0，則樣品稀釋形容引入的不確定度就為

2.3 樣品測量中引入的不確定度

樣品測量不確定性主要源于測量重復性。對定值樣品中的維生素B6含量進行平行測定，測定次數為8，得出結果分別結果如表1所示。根據貝塞爾公式，計算得出標準不確定度相對標準不確定度約等于0.000 363。則微生物法測定米粉中維生素B6的總不確定度為：0.032 30+0.087 034 2+0.000 363=0.119 697 2。

表1 樣品重復性測定結果（n=8）

3 結論

微生物法測定米粉中維生素B6含量不確定度主要來源于樣品稱量、樣品稀釋定容、樣品測量等幾個環節，涉及了標準品純度、天平自身精密度、移液器與容量瓶容差、樣品測定重復性、試驗環節溫度變化等幾個方面。測定人員應嚴格依據GB 5009.154—2016的要求，進行微生物法操作，為米粉安全監管提供充足支持。